猪胎盘抗衰老药效物质基础及相关作用机制研究

摘要

人胎盘是一种具有补肾益精、补血益气等功效的传统中药，但猪胎盘的相关研究却鲜有报道。猪为哺乳动物，猪胎盘容易获得，功效与人胎盘应具有相似和可比性。本实验对猪胎盘进行药效物质基础研究，以组织冻融法提取猪胎盘蛋白(Pig Placenta Protein，PPP)并制备其凝胶剂(Pig placenta protein gel，PPPG)，考察其基本性质及功效，为猪胎盘的废物利用提供依据。主要研究内容及结果如下:
　　1.猪胎盘蛋白的提取及成分研究
　　新鲜的猪胎盘组织先用机械粉碎法粉碎，再经冻融、匀浆、过滤得到PPP，冻干保存。测定其总蛋白含量，并采用薄层色谱(TLC)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)等分析方法对PPP的组成成分进行分析。结果表明:得到的PPP为浅黄色的透明溶液，冻干粉为乳白色絮状粉末;TLC检测出7个斑点，Rf值分别为0.06、0.08、0.23、0.27、0.34、0.47、0.54;紫外波谱扫描图谱显示其最大吸收波长为260nm;微量元素分析结果为:PPP溶液中含有丰富的Ca、P、K、Mg、Zn、Fe等人体不可缺少的营养元素;红外光谱扫描结果显示其在3400cm-1和1630cm-1附近都有明显的振动峰;SDS-PAGE得到7个电泳条带，经MALDI-TOF MS鉴定，按照分子量从大到小的顺序依次为:葡萄糖调节蛋白78、热休克蛋白8、蛋白质二硫键异构酶A3前体蛋白、脯氨酰4-羟化酶β多肽、β细胞骨架肌动蛋白片段、醛糖还原酶、β血红蛋白亚基。
　　2.猪胎盘蛋白对小鼠体内DA含量的影响
　　将正常小鼠和D-半乳糖诱导衰老的小鼠按不同剂量的PPP（高浓度:1g·kg-1·d-1，中浓度:0.5g kg-1·d-1，低浓度:0.25g·kg-1·d-1）灌胃给药，给药35天后，通过脑组织和血液同步采样的方法，结合酶联免疫分析(ELISA)法检测各组小鼠脑组织和血液中多巴胺(DA)含量，考察其对体内DA能神经元的影响。
　　实验数据表明:正常小鼠阳性对照组、PPP高、中、低浓度组的脑组织内DA水平与正常小鼠空白组比较分别显著增加了58.0％(p＜0.01)，59.0％(p＜0.01)，37.6％(p＜0.01)和30.2％(p＜0.05);衰老小鼠的体内DA含量明显降低，阳性对照组、PPP高、中、低浓度组的脑组织内DA水平与模型组比较分别显著升高了95.5％(p＜0.01)，101.3％(p＜0.01)，79％(p＜0.01)和67.1％(p＜0.01)。正常小鼠阳性对照组、PPP高、中、低浓度组的血液中DA含量与正常小鼠空白组比较分别增加11.9％(p＜0.05)，10.5％(p＜0.05)，6.2％(p＞0.05)和3.2％(p＞0.05);衰老小鼠阳性对照组、PPP高、中、低浓度组小鼠的血液中DA含量与模型组比较分别增加了30.1％(p＜0.01)，15.7％(p＜0.05)，8.8％(p＜0.05)和5.5％(p＞0.05)。
　　3.猪胎盘蛋白凝胶剂的制备及其功效考察
　　将12g盐酸化壳聚糖加到25mL纯化水中，溶胀溶解形成凝胶液;向132g PPP冻干粉中加入25mL纯化水形成溶解液;凝胶液和溶解液合并均质2min，加入6g甘油再均质2min即得PPP凝胶剂。测定PPP凝胶的粘度、pH、总蛋白浓度等指标，扫描电子显微镜(SEM)观察凝胶剂的结构。将PPP凝胶涂抹于D-半乳糖诱导衰老的小鼠和深Ⅱ度烫伤的大鼠皮肤，给药35天后，通过HE染色法考察PPP凝胶对各组动物皮肤组织中表皮形态和厚度的影响，同时采用RT-PCR检测皮肤组织中Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平。
　　结果表明:制备的PPP凝胶为均匀、细腻的黄色半固体物质，粘度为（4.5±0.1）Pa·s、pH为6.6～6.9，总蛋白含量为5％，易涂布、易清洗，符合凝胶制剂要求。皮肤组织切片表明PPP凝胶能使衰老和烫伤动物的整体及创伤处皮肤表皮厚度增加;RT-PCR显示PPP凝胶剂组的动物皮肤组织中Ⅰ型前胶原mRNA表达均明显升高(p＜0.05)。
　　本实验提取和鉴定了猪胎盘中可增强细胞活力和人体免疫功能的蛋白类物质，确认其与猪胎盘提取物明显的抗氧化抗衰老作用相关，显示其在保健和医药领域的应用价值和应用前景，值得借鉴。

目录

摘要

符号说明

第一章 前言

1 胎盘的研究现状

1．1 胎盘的药理作用

1．2 胎盘的有效成分

2 水凝胶的研究现状

2．1 水凝胶及其结构特点

2．2 水凝胶的分类

2．3 凝胶在药物制剂中的作用

3 本文的立题依据及主要研究内容

参考文献

第二章 猪胎盘蛋白的提取及其成分研究

1 仪器与材料

1．1 仪器

1．2 材料与试剂

2 实验方法与结果

2．1 PPP的提取及冻干粉的制备

2．2 PPP冻干粉中总蛋白含量的测定

2．3 薄层色谱法分析

2．4 光谱分析

2．6 MALDI-TOF质谱鉴定

3 讨论及小结

参考文献

第三章 猪胎盘蛋白对小鼠体内DA含量的影响

1 仪器与材料

1．1 仪器

1．2 动物

1．3 材料及试剂

2 实验方法与结果

2．1 动物的分组及给药情况

2．2 生物样品处理

2．3 统计学处理

2．4 生物样品中DA含量的测定

3 讨论及小结

参考文献

第四章 猪胎盘蛋白凝胶剂的制备及其对皮肤的药效考察

1 仪器与材料

1．1 仪器

1．2 动物

1．3 材料及试剂

2 实验方法与结果

2．1 猪胎盘蛋白凝胶剂的制备及其性质研究

2．2 动物的模型建立及其给药

2．3 外观及皮肤组织形态学考察结果

2．4 RT-PCR检测正常组小鼠皮肤中I型前胶原mRNA的表达

2．5 数据处理

2．6 各组Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平比较

3 讨论及小结

3．1 药物剂型及凝胶基质的选择

3．2 实验动物的选择

3．3 阳性对照药物的选择

3．4 衰老基因评价指标的选择

参考文献

全文总结

致谢

读研期间发表论文及参与项目情况

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