仔猪肠道屏障完整性的评价及其候选基因的筛选

摘要

肠道不仅是猪体内重要的消化吸收器官，同时也是机体抵抗病原菌侵袭的第一道防线。肠道屏障能够防止肠内的细菌和病毒产生的有害物质穿过肠粘膜进入机体血液循环中，肠道屏障的受损与众多疾病具有密切的相关性。猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）导致的一种高度接触性肠道传染病，尤其在仔猪中具有很高的发病率和死亡率，研究发现肠道屏障的受损是导致在仔猪中发病率较高的腹泻和肠道炎症等疾病的重要内因之一。PEDV毒株的基因变异导致变异株毒力增强以及现有疫苗难以有效免疫，从遗传本质上增强仔猪对PEDV的抗性，从长远来看可能是抵抗PEDV侵害的有效方法。因此，从分子遗传学角度出发筛选与仔猪肠道屏障相关的关键候选基因，对于猪抗PEDV育种工作具有重要的科学价值和应用前景。
　　本研究以43头“杜×长×大”8日龄三元杂交猪为研究对象，其中腹泻仔猪个体28头，正常仔猪个体15头。首先进行PEDV经典毒株RT-PCR检测，然后利用血清D-乳酸和DAO的ELISA含量检测初步鉴定腹泻和正常仔猪个体的肠道通透性，同时屠宰仔猪采集各肠道组织并利用扫描和透射电镜直观观察结合石蜡切片的系列检测进一步验证仔猪肠道屏障完整性，以获得确证的肠道屏障完整和受损仔猪个体表型。对肠道屏障完整和受损仔猪个体肠道粘膜使用RNA-seq测序技术筛选重要调控通路及差异表达基因，并对重要候选基因进行个体和细胞水平的初步功能验证，主要试验结果如下:
　　1、基于M基因的序列使用邻接法建立进化树发现腹泻病猪肠道内的毒株与目前国内外的PEDV流行株具有较高的同源性，由此确认本研究中的腹泻病猪均为PEDV病毒感染。然后采用血清D-乳酸和DAO含量检测从腹泻和正常个体中共剔除仔猪15头，初步将仔猪鉴定为肠道屏障完整组和受损组。扫描和透射电镜以及石蜡切片染色的结果显示，典型的肠道屏障完整仔猪肠黏膜结构完整，层次分明，绒毛长度和宽度均显著高于受损个体(P＜0.05)，黏膜上皮细胞的轮廓清晰，排列规则，杯状细胞数量较多。典型的肠道屏障受损仔猪肠道发生明显病变，肠道绒毛脱落，破损，固有层暴露，肠腺萎缩，杯状细胞数量较少。最终成功获得确证的肠道屏障受损仔猪10头，肠道屏障完整仔猪12头。本研究使用血清D-乳酸和DAO的ELISA含量检测、肠道组织扫描和透射电镜直观观察、石蜡切片检测等一系列实验建立了仔猪肠道粘膜屏障完整性的评价体系，最终成功获得了确证的肠道屏障受损和完整仔猪个体，为下一步仔猪抗腹泻病等肠道疾病的研究工作提供了宝贵的素材，同时为今后猪肠道屏障研究素材的获得提供了一个有效可行的方法和途径。
　　2、使用RNA-seq技术对肠道屏障完整和受损仔猪空肠粘膜组织进行转录组测序，分别获得110.62、101.07、129.27、100.18和113.57、108.03、99.84、111.55百万个raw reads，采用HISAT2对过滤后的reads进行参考基因组的比对分析后发现Total mapped在90.75％～95.41％之间，超过70％的预期结果。3.11％～6.78％的reads在参考基因组序列上具有多处比对位置，85.43％～91.76％的reads比对位置唯一。根据p-adjust＜0.05的原则，在肠道屏障完整组和受损组之间共筛选出差异表达基因(differentially expression genes，DEGs)3721个，其中受损组上调基因具有2151个，下调基因1570个。根据GO富集分析的结果筛选得到57条显著富集的GO分类（22条BP，11条CC，24条MF），CC主要包括细胞内部分(intracellular part)、细胞内细胞器(intracellular organelle)和细胞器(organelle)等，MF主要包括核苷酸结合域(nucleotide binding)、核苷磷酸结合(nucleoside phosphate binding)和小分子结合(small molecule binding)等。KEGG分析显示DEGs主要被富集到甘油酯代谢(Glycerolipid metabolism)、磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidylinositol signaling system)和肌醇磷酸盐代谢(Inositol phosphate metabolism)等通路中。
　　3.基于基因的高表达差异倍数和生物学功能筛选了SELE、LRRK1、1TPR2、EDA、KIAA1429、PRAP1、ALPI、SDR16C5、CLDN10、ASAH、AGPAT3和KCNJ12等12个重要的候选基因，并利用实时荧光定量PCR验证转录组测序的分析结果，发现实时荧光定量的结果与转录组测序结果一致，表明转录组测序的结果准确度较高。进一步在细胞水平上通过PEDV感染IPEC-J2细胞检测这12个候选基因的表达变化，结果发现在感染PEDV病毒后这些候选基因没有发生显著的差异表达，进一步证实这些候选基因可能并不直接参与仔猪抗PEDV感染的免疫应答，而是通过维持或提高仔猪肠道屏障的完整性来抵抗PEDV感染。

目录

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 猪流行性腹泻

1．1 猪流行性腹泻的病原及危害

1．2 国内猪流行性腹泻的历史和现状

2 肠道屏障的研究进展

2．1 机械屏障

2．2 生物屏障

2．3 免疫屏障

2．4 化学屏障

3 转录组测序的简介及其在猪中的应用

4 研究目的和意义

第二章 猪肠道屏障完整性评价体系的建立

1 材料与方法

1．1 试验动物与材料

1．2 主要试剂及仪器

1．3 猪肠道屏障受损和完整性的初步确定

1．4 肠道屏障受损和完整性个体的确证

1．5 数据处理与分析

2 结果与分析

2．1 猪肠道屏障受损和完整性的初步确定

2．2 肠道屏障受损和完整性个体的确证

2．3 肠道屏障完整和受损仔猪个体的确证结果

3 讨论

第三章 仔猪肠道屏障相关调控通路、差异表达基因的筛选与验证

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 主要实验试剂仪器及分析软件

1．3 总RNA的提取、建立文库和上机测序

1．4 数据统计与生物信息学分析

1．5 仔猪空肠粘膜的实时荧光定量PCR验证

1．6 差异表达基因在PEDV感染IPEC-J2细胞后的表达变化

2 结果与分析

2．1 肠道屏障样本和测序数据的质量评估

2．2 可变剪切分析

2．3 样品间表达相关性检查

2．4 差异表达基因分析

2．5 GO功能和pathway通路富集分析

2．6 差异表达基因的实时荧光定量RCR结果

2．7 PEDV感染IPEC-J2细胞后DEGs的表达变化

3 讨论

全文结论与创新点

参考文献

致谢

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