虫草素对MPTP诱导的帕金森病小鼠多巴胺能神经元的保护作用及其机制研究

摘要

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是以锥体外系功能障碍为主要表现的中枢神经系统退行性疾病，其特征性病理改变为黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元渐进性变性死亡，现有的治疗药物尚不能抑制这一病变的进展，因此，寻找能够阻止PD病程的神经保护剂具有重要意义。虫草素(Cordycepin)是蛹虫草（北冬虫夏草）中的活性成分。本实验室前期研究发现，在鱼藤酮诱导的PD动物和细胞模型上，它能够保护DA能神经元，此与改善线粒体功能障碍有关。虫草素的上述作用尚有待在其他模型上进一步证实，同时，有必要对其作用机制作深入研究。
　　目的:
　　研究虫草素对MPTP诱导的PD小鼠DA能神经元的保护作用，并从内质网应激和神经炎症角度探讨其可能的作用机制。
　　方法:
　　小鼠分为对照组、模型组和虫草素低剂量(5.0mg/kg)、中剂量(10.0mg/kg)、高剂量（20.0mg/kg）组。腹腔注射MPTP(30mg/kg/d)，连续5天，制备PD模型。以旷场实验、爬杆实验和转棒实验测试小鼠行为学变化。应用免疫组织化学方法观察TH免疫阳性神经元数目和DAT变化，以及小胶质细胞和星形胶质细胞的活化状态及Iba-1和GFAP免疫阳性细胞数量。HPLC-EC法检测DA、5-HT及其代谢产物的含量。TUNEL染色法观察细胞凋亡形态和数量变化。分光光度法测定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。应用Western-blot法检测TH、Caspase3、Cleaved-caspase3、GRP78、CHOP、Caspase12、NF-κB p65和iNOS的蛋白表达，同时应用RT-qPCR方法测定GRP78、CHOP、TNF-α和IL-1βmRNA表达水平。ELISA法测定外周血中TNF-α和IL-1β的含量。
　　结果:
　　1.虫草素对MPTP诱导的PD小鼠DA能神经元的保护作用研究
　　与对照组相比，模型组小鼠在旷场内自主活动距离明显减少（P＜0.01），爬杆时间显著增多(P＜0.01)，转棒潜伏期明显缩短(P＜0.01)。模型组小鼠SN中TH免疫阳性神经元明显减少(P＜0.01)，TH蛋白表达显著下调(P＜0.01)。Str内DAT水平显著降低（P＜0.01），DA及其代谢产物以及5-HT含量显著下降（DA、DOPAC和5-HT，P＜0.01;HVA，P＜0.05）。
　　与模型组相比，10.0mg/kg虫草素处理后能够显著增加小鼠的移动距离和活动时间(P＜0.01)，5.0、10.0、20.0mg/kg虫草素均能够显著减少爬杆时间(P＜0.01)，并显著延长转棒潜伏期（5.0mg/kg，P＜0.05;10.0和20.0mg/kg，P＜0.01）。表明小鼠上述行为学障碍得到改善。5.0和10.0mg/kg虫草素处理后，SN中TH免疫阳性神经元数量(P＜0.01)和TH蛋白表达明显增多（5.0mg/kg，P＜0.05;10.0mg/kg，P＜0.01），Str内DAT水平显著提高(P＜0.01)。虫草素三个剂量组均显著增加DA含量（5.0和10.0mg/kg，P＜0.01;20.0mg/kg，P＜0.05），5.0和10.0mg/kg虫草素显著增加HVA含量（P＜0.05），10.0mg/kg虫草素显著增加5-HT的含量(P＜0.01)。虫草素的上述作用以10.0mg/kg组最好，20.0mg/kg作用最弱或不显著。结果提示虫草素在一定剂量范围内对MPTP诱导的PD小鼠DA能神经元具有保护作用。
　　2.虫草素对MPTP诱导的PD小鼠DA能神经元保护作用机制研究
　　(1)对细胞凋亡的影响:模型组小鼠SN中凋亡细胞核固缩，胞体呈圆形或椭圆形。与对照组相比，凋亡细胞的数量显著增加(P＜0.01)。同时Caspase3和Cleaved-caspase3蛋白表达明显上调(P＜0.01)。与模型组相比，虫草素处理能够显著减少细胞凋亡数量(5.0和10.0mg/kg，P＜0.01;20.0mg/kg，P＜0.05)，明显下调Cleaved-caspase3蛋白表达(P＜0.01)，但对Caspase3蛋白表达没有显著影响（P＞0.05）。结果表明，虫草素可能通过抑制Caspase3的激活而抑制细胞凋亡。
　　(2)对抗氧化酶活性的影响:与对照组相比，模型组小鼠SN中SOD(P＜0.01)和GSH-Px(P＜0.05)活性显著下降，MDA含量显著增加(P＜0.01)。与模型组相比，5.0和10.0mg/kg虫草素处理后，SOD和GSH-Px活性均明显提高(P＜0.01)，MDA含量显著降低(P＜0.05)。20.0mg/kg虫草素组上述指标虽有变化，但均无显著性意义（P＞0.05）。
　　(3)对内质网应激的影响:与对照组相比，模型组的GRP78、CHOP和Caspase12蛋白表达量显著增加(P＜0.01)，GRP78和CHOP的mRNA水平也显著增加(P＜0.01)。与模型组相比，虫草素处理能够显著下调GRP78(10.0mg/kg，P＜0.01;5.0和20.0mg/kg，P＜0.05)、CHOP(5.0和10.0mg/kg,P＜0.01;20.0mg/kg,P＜0.05)和Caspase12(10.0mg/kg，P＜0.01;5.0mg/kg，P＜0.05)蛋白表达。5.0和10.0mg/kg虫草素能显著降低GRP78（5.0mg/kg，P＜0.05;10.0mg/kg，P＜0.01）和CHOP(P＜0.01)的mRNA表达水平。20.0mg/kg虫草素也显著降低CHOP mRNA的表达(P＜0.05)，GRP78mRNA表达虽有下降，但没有统计学意义(P＞0.05)。提示虫草素可抑制MPTP诱导的内质网应激。
　　(4)对炎症反应的影响:与对照组比较，模型组小鼠SN中小胶质细胞分支变多、突起缩短，星形胶质细胞突起变粗、呈放射状，Iba-1和GFAP免疫阳性细胞数量均显著增多(P＜0.01)。同时，iNOS和NF-κB p65蛋白表达显著增加(P＜0.01)，TNF-αmRNA和IL-1βmRNA表达水平显著上升(P＜0.01)，血清中IL-1β（P＜0.05）和TNF-α(P＜0.01)的含量也显著增加。与模型组相比，虫草素处理后，Iba-1和GFAP免疫阳性细胞数量均显著减少(P＜0.01)，iNOS和NF-κB p65蛋白表达显著下调（5.0和10.0mg/kg，P＜0.01;20.0mg/kg，P＜0.05），TNF-αmRNA和IL-1βmRNA的表达下调(P＜0.01)，血清中TNF-α(P＜0.01）和IL-1β（5.0mg/kg，P＜0.05;10.0mg/kg，P＜0.01）的含量明显下降。上述作用中，10.0mg/kg虫草素作用最显著。结果提示虫草素能够减轻MPTP诱导的神经炎症和外周炎症。
　　结论:
　　虫草素在一定剂量范围内对MPTP诱导的PD小鼠DA能神经元具有保护作用，这一作用可能与其提高抗氧化酶活性、抑制内质网应激和炎症反应从而抑制细胞凋亡有关。

目录

摘要

符号说明

1 前言

1．1 PD治疗现状

1．2 PD发病机制

1．2．1 PD与内质网应激

1．2．2 PD与神经炎症

1．2．3 ESR与炎症反应的关系

1．3 虫草素的药理活性

1．3．1 抗炎作用

1．3．2 抗氧化应激作用

2 实验仪器和试剂

2．1 实验动物

2．2 药品和试剂

2．3 仪器设备

2．4 试剂配置

3 实验方法

3．1 MPTP造模

3．2 分组

3．3 给药方法

3．4 行为学测试

3．4．1 旷场实验

3．4．2 爬杆实验

3．4．3 转棒实验

3．6 HPLC-EC检测DA、5-HT及其代谢产物含量

3．7 TUNEL法检测细胞凋亡

3．8 SOD、GSH—Px活性和MDA含量测定

3．8．1 SOD的活性测定

3．8．2 GSH-Px的活性测定

3．8．3 MDA含量测定

3．9 Western Blot检测TH、Caspase 3、Cleaved—caspase 3、GRP78、CHOP、Caspase 12、iNOS和NF-kB p65蛋白表达

3．9．1 脑组织总蛋白的提取

3．9．2 BCA蛋白定量

3．9．3 Western Blot

3．10 RT-qPCR检测GRP78、CHOP、TNFα和IL-1β mRNA表达

3．10．1 总RNA的提取

3．10．2 RNA质量检测

3．10．3 引物序列

3．10．4 逆转录为cDNA

3．10．5 PCR扩增

3．11 ELISA法测定血清中TNF-α、IL-1β的含量

3．12 统计学检验

4 实验结果

4．1 Cor对PD小鼠行为学的影响

4．1．1 旷场实验结果

4．1．2 爬杆实验结果

4．1．3 转棒实验结果

4．2 Cor对PD小鼠黑质-纹状体DA能神经元的影响

4．2．3 对DA、5-HT及其代谢产物含量的影响

4．3 Cor对PD小鼠黑质DA能神经元凋亡的影响

4．4 Cor对PD小鼠黑质SOD、GSH-Px和MDA的影响

4．5 Cor对PD小鼠黑质ERS的影响

4．5．1 对GRP78、CHOP和CaSpase 12蛋白表达的影响

4．5．2 对GRP78和CHOP的mRNA表达的影响

4．6 Cor对PD小鼠炎症反应的影响

4．6．1 摄制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化

4．6．2 对iNOS和NF-κB p65蛋白表达的影响

4．6．3 对TNF-α和IL-1β的mRNA表达的影响

4．6．4 对血清中TNF-α和IL-1β含量的影响

5 讨论

5．1 Cor对DA能神经元的保护作用

5．2 Cor的神经保护作用机制

5．2．1 抑制DA能神经元凋亡

5．2．2 提高抗氧化酶活性，抑制氧化应激

5．2．3 抑制ERS

5．2．4 抑制炎症反应

6 小结

结论

参考文献

文献综述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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