GRP78和MC5R基因与肥肝鹅生产性能的关系

摘要

鹅脂肪肝(俗称肥肝）是一种营养丰富的高档食材。不同品种的鹅产肝性能存在明显差异，这表明鹅肥肝生产性能可通过遗传育种途径加以改良。目前中国用于肥肝生产的鹅品种是从国外引进的朗德鹅，由于引种费用昂贵，许多肥肝生产企业为了有利可图，常常购买引进后已多次传代、种质退化了的群体，严重影响了企业的生产效率和收益。解决这一问题的有效途径之一是对中国引进的朗德鹅群体进行选种，然而目前采用的表型选择，其选种效果并不明显。相对于表型选择，遗传标记辅助选择的优势明显。本研究旨在评估GRP78和MC5R两个基因与脂肪肝形成的关系及其多态性位点与肥肝鹅相关生产性状的关联，从而为肥肝鹅的标记辅助选择奠定基础。本研究的主要结果如下:
　　1、利用荧光定量PCR检测GRP78基因在填饲第7天、14天和19天对照组（常规饲养组）和填饲朗德鹅不同组织（肝脏、腹脂和胸肌）中的表达情况。结果显示:在填饲第7天、14天和19天，填饲组朗德鹅肝脏中GRP78基因的mRNA表达量均低于对照组朗德鹅，但未达到统计显著性(P＞0.05）;相反，填饲组朗德鹅腹脂中GRP78基因的mRNA表达量均高于对照组朗德鹅，且在填饲第14天达到统计显著性(P＜0.05）。然而，胸肉中GRP78基因的mRNA表达量在两组间没有明显差异。再者，在饲料中添加蔗糖导致肥肝中的GRP78表达量进一步被抑制，同时伴有肥肝重和腹脂重的增加，该结果表明GRP7参与鹅肥肝的形成，其表达抑制或有助于肥肝的形成。因此，GRP78是鹅肥肝辅助选择标记的良好候选基因。为探讨GRP78基因用作辅助选择标记的可行性，本研究通过PCR扩增出GRP78基因及其上游序列(＜2.5kb)并测序以筛查该基因存在的SNP位点。结果发现仅在上游序列较远的位置(-1904bp～-2484bp)上存在6个SNP位点，且这些位点与测定的生产性能指标不存在显著关联，而在其他序列中并未找到SNP位点。GRP78基因编码区没有找到多态性位点反映出GRP78基因因具有重要的生物学功能而承受了较大的选择压力。
　　2、利用荧光定量PCR检测MC5R基因在填饲第7天、14天和19天对照组和填饲组朗德鹅不同组织（肝脏、腹脂和胸肌）中的表达情况。结果显示:在填饲第7天、14天和19天MC5R基因在填饲组朗德鹅肝脏中的表达均显著低于对照组，且随着肝中脂肪沉积量的增加，MC5R的表达抑制变得更加明显。类似地，填饲组腹脂中MC5R基因的表达量均显著低于对照组。对于胸肌而言，在填饲第7天，填饲组与对照组间没有明显差别;在填饲第14天，填饲组低于对照组，但不显著;而在填饲第19天，填饲组显著低于对照组，且表达的抑制程度加剧。此外，与常规填饲组相比，加糖日粮的填饲进一步抑制肥肝中的MC5R表达，且这种抑制与肝重增重相关。这些结果提示，MC5R基因的表达抑制可能促进组织中的脂肪沉积，因此MC5R基因是鹅肥肝辅助选择标记的良好候选基因。
　　3、为了更好地理解MC5R与鹅肥肝形成的关系，本项目检测了脂肪肝形成相关因子（高剂量葡萄糖、胰岛素和脂肪酸）对鹅原代肝细胞中MC5R基因表达的影响。结果显示:在高剂量葡萄糖、胰岛素、棕榈酸、油酸和亚油酸分别处理鹅原代肝细胞14小时后，葡萄糖和胰岛素都不同程度地诱导了MC5R的表达，而脂肪酸对MC5R表达没有显著的调节作用。这些结果与鹅肥肝组织的表达情形不一致，推测在鹅肥肝形成过程中，还存在其他因子或机制影响鹅肥肝中MC5R基因的表达。
　　4、为探讨MC5R用作肥肝鹅辅助选择标记的可能性，本研究通过对PCR产物进行测序分析，查找MC5R编码区内的SNP位点，并对SNP位点与生产性能相关指标（肝重、腹脂重和胴体重）进行关联分析。数据显示:在MC5R基因编码区找到一个C/T多态性位点（起始密码子下游编码区序列的807bp处），该SNP位点并未引起MC5R氨基酸序列的改变。该SNP位点与肥肝鹅的腹脂重存在关联。CT基因型的平均腹脂重显著大于CC基因型的平均腹脂重(P＜0.05），两者相差52.67g;而TT基因型与CC、CT基因型在平均腹脂重的差异未达到显著水平。SNP位点与肥肝鹅的胴体重也存在关联，CC基因型的平均胴体重显著大于TT基因型的平均胴体重(P＜0.05)，两者相差630g;而CT基因型与CC、TT基因型在平均胴体重上的差异未达到显著水平。然而，SNP位点与肥肝鹅的平均肝重不存在明显关联。这些结果从关联分析的角度表明，MC5R或可用于肥肝鹅的辅助选择，在保持肝重不受显著影响的情况下，对填肥后的腹脂重和胴体重进行选择。
　　综上所述，通过明晰朗德鹅不同组织中GRP78和MC5R基因表达水平随填饲时间的变化规律、饲料加糖试验和脂肪肝形成相关因子对基因表达的影响，以及基因的SNP位点与肥肝鹅生产性能相关指标间的关联情况，本研究揭示了GRP78与MC5R基因在肝脏中的表达抑制有助于鹅肥肝的形成，因此两者均为肥肝鹅辅助标记的良好候选基因;在MC5R编码区筛选到的SNP或可作为辅助选择标记用于肥肝鹅腹脂重和胴体重的选择。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 鹅肥肝生产与研究现状

2 内质网应激(ERS)及其标记分子葡萄糖调节蛋白78基因(CRP78)

3 促黑皮质激素5的介绍及研究进展

4 分子遗传标记技术

5 本研究的目的、意义和主要研究内容

第二章 GRP78基因与鹅肥肝形成及相关生产性状的关系研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 GRP78基因在不同时期朗德鹅不同组织中的表达规律

3．2 GRP78基因核酸多态性位点与肥肝鹅相关生产性状的关联分析

4 讨论

第三章 MC5R基因与鹅肥肝形成及相关生产性状的关系研究

2．1 实验材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 MC5R基因在不同时期朗德鹅不同组织中的表达规律

3．2 脂肪相关因子处理对MC5R基因表达的影响

3．3 MC5R基因多态位点的筛选及分析

4 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

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