H5N1-NS1基因的融合表达及RNAi技术抑制BmNPV增殖的研究

摘要

禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类感染的疾病综合症，是危害目前养禽业最严重的疫病之一。已有研究表明H5N1-NS1蛋白可以作为诊断试剂来鉴别诊断免疫动物和自然感染动物，因而开展NS1蛋白的研究在禽流感防治方面具有较高的应用价值。 本研究将人工合成的H5N1-NS1基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)中，在大肠杆菌BL21中诱导表达，结果表明：大肠杆菌中表达的重组蛋白分子量为31 kD，与理论值相符，此外还有一条分子量为15 kD左右的特异性条带，推测与大肠杆菌密码子的偏爱性或表达产物降解有关；同时将H5N1．NSl基因克隆进杆状病毒转移载体pFastBacHT A中，通过Bae toBae系统在Sf-9细胞中进行表达，表达的重组蛋白为33 kD，比预测的融合蛋白分子量30.5 kD略大，推测与表达产物的后加工有关。 开展了基于DNA载体的RNAi抑制家蚕核多角体病毒(BmNPV)复制的研究。用人工合成“A3 promoter-Sence lef-1-TCAAGAG-Antisenee lef-1-TTTTT-polyA signal”的结构元件，构建基于piggyBAC转座子的piggy-A3-left-neo转基因载体，转染piggy-A3-left-neo的BmN细胞，对BmNPV的增殖有明显的抑制效果。转染piggy-A3-left-neo的BmN细胞，经G418筛选两个月后，获得了阳性率为70％的转基因细胞，试验表明，该转化细胞对BtaNPV有较好的抗性。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分文献综述

第一章H5N1亚禽流感病毒的研究进展

1禽流感病毒概述

2禽流感病毒的致病机理

3 NS1蛋白的结构与功能

4禽流感的防治

参考文献：

第二章昆虫杆状病毒表达载体系统

1杆状病毒表达系统的原理

2杆状病毒表达系统的优缺点

3杆状病毒表达系统的改进

4杆状病毒表达系统的应用前景

参考文献

第三章RNAi的研究进展

1 RNAi作用机制

2 RNAi相关的蛋白

3 RNAi与DNA甲基化

4 RNAi技术要点

5 RNAi技术的应用

6 RNAi技术在杆状病毒分子生物学研究

参考文献：

第二部分正文

第四章材料与方法

1实验材料

2实验常用仪器设备

3常用方法

参考文献

第五章H5N1-NS1基因在E.coli中的表达研究

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第六章H5N1-NS1基因在昆虫细胞中的表达研究

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献：

第七章RNAi-DNA载体的构建

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第八章RNAi抑制BmNPV增殖和转基因细胞的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献：

第九章其它研究工作——中国野桑蚕mtDNA中Cyt b基因的克隆及序列分析

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

结论

附录

致谢