少突胶质谱系细胞发育过程中S-100β的表达及易损性的研究

摘要

O-2A祖细胞是双潜能干细胞，既能分化为少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)，又能分化为2型星形胶质细胞。从O-2A祖细胞发育到成熟的OL这个过程中往往伴随着一些抗原的消失和出现。 本文研究在OL发育过程中S-100β表达的变化。S-100β属于S100家族的一个钙离子结合蛋白，它广泛的分布在脊椎动物的神经系统，沉积在哺乳动物的脑中S-100β，参与细胞类型的分化。在分离、纯化和体外培养O-2A祖细胞的基础上，检测S-100β在O-2A祖细胞分化至成熟OL的过程中S-100β表达的变化，探讨S-100β是否在OL发生与分化过程中具有调控作用。脑室周围白质的软化(Periventricular leukomalaeia，PVL)主要是发生在早产儿的一种白质的损伤，发育中的少突胶质谱系细胞的损伤是PVL的一个标志性特征。据临床和动物实验报道促炎症因子TNF-α在PVL中发挥作用，因此研究其对发育中少突胶质谱系细胞的作用非常重要。全文分为两部分内容： 第一部分、少突胶质谱系细胞发育过程中S-100β的表达。 目的：探讨新生大鼠大脑皮质来源的少突胶质谱系细胞中S-100β是否表达，如若表达始于少突胶质谱系细胞发育过程中的何种阶段。 方法：取新生大鼠大脑皮质进行混合胶质细胞的原代培养，根据各种胶质细胞黏附性及生长时间的差异，通过机械振荡法和差速贴壁法获得纯化的O-2A祖细胞，并结合使用生长因子获得一系列的少突胶质谱系细胞，且通过细胞特异性抗体进行鉴定。采用免疫荧光双重标记方法，检测S-100β在少突胶质谱系细胞中的表达情况。 结果：纯化的O-2A祖细胞在含有bFGF和PDGF的培养液中培养48 h，不表达S-100β。换成含3'碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3)培养液继续培养24 h，开始表达S-100β。原少突胶质细胞和成熟的OL中S-100β免疫反应呈现阳性。 结论：S-100β表达始于O-2A祖细胞分化为原少突胶质细胞的阶段，可能与O-2A祖细胞从双潜能阶段分化成OL过程中的形态学变化有关。 第二部分、少突胶质谱系细胞易损性的研究 目的：研究TNF-α对少突胶质谱系细胞的三个不同发育阶段的易损性。 方法： (1)5ng／ml、50 ng／ml、500 ng/ml TNF-α分别刺激O-2A祖细、原少突胶质细胞、未成熟的OL48 h，同时设立对照组(未加TNF-α处理)。利用MTT法以酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值(OD)，计算细胞的存活率。存活率(-X±s)％=实验组细胞OD／对照组细胞ODx100％。 (2)50 ng/ml TNF-α刺激O-2A祖细、原少突胶质细胞、未成熟的OL12 h、24 h、48 h，以未加TNF-α处理的为对照组，利用MTT法计算细胞的存活率。存活率(-X±s)％=实验组细胞OD／对照组细胞ODx100％。 (3)50 ng／ml TNF-α刺激O-2A祖细、原少突胶质细胞、未成熟的OL48 h，caspase-3的免疫细胞化学染色检测细胞的凋亡。 结果： (1)TNF-α降低细胞的存活率具有剂量依赖性和时间依赖性，随着TNF-α剂量的增加和刺激时间的延长O-2A祖细胞、原少突胶质细胞、未成熟OL的存活率降低。 (2)随着TNF-α剂量的增加，0-2A祖细胞与未成熟OL相比较细胞存活率明显降低(P<0.01)，原少突胶质细胞与未成熟OL相比较细胞存活率也是降低的(P<0.05)，O．2A祖细胞存活率与原少突胶质细胞存活率相比较差别没有统计学意义；50 ng/ml FNF-α刺激少突胶质谱系细胞48 h以内，O-2A祖细胞的存活率与未成熟OL存活率相比较差别没有统计学意义，O-2A祖细胞的存活率与原少突胶质细胞的存活率相比较也不存在差别，而原少突胶质细胞的存活率与未成熟OL存活率相比较细胞的存活率明显降低(P<0.05)。 (3)50 ng/ml TNF-α分别刺激O-2A祖细胞、原少突胶质细胞、未成熟OL48 h，caspase-3免疫细胞化学染色显示在这些细胞的胞浆和胞核有大量的特异性棕黄色的着色而对照组这三个发育阶段的细胞未见阳性表达。 结论：TNF-α降低少突胶质谱系细胞的存活率具有细胞成熟程度的依赖性；caspase-3参与TNF-α诱导的O-2A祖细胞、原少突胶质细胞及未成熟OL的凋亡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表(Abbreviation)

声明

前 言

第一部分少突胶质谱系细胞发育过程中S-100β的表达

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分少突胶质谱系细胞易损性的研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

结 论

Olig基因在中枢神经系统发育和疾病过程中的功能

攻读学位期间发表论文

致 谢