内吗啡肽和Mu阿片受体在小鼠树突状细胞的表达及其相关功能的研究

摘要

目的：研究内吗啡肽-1和内吗啡肽-2以及Mu阿片受体在小鼠树突状细胞的表达及其相关的功能。 方法：从7-8周龄的C57BL/6J小鼠骨髓提取骨髓前体细胞培养，经CD11c免疫磁珠分选，获得纯化的树突状细胞。流式细胞仪分析表明，CD11c(树突状细胞的特异性标记)阳性细胞纯度达95％以上。首先，研究Mu阿片受体是否在鼠树突状细胞表达。用RT-PCR的方法，检测Mu阿片受体基因在树突状细胞上的表达；用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光染色，观察Mu阿片受体蛋白在树突状细胞上的表达；同时，用定量PCR的方法，研究了不同Toll样受体(TLR)的配体对Mu阿片受体基因表达的调控。其次，研究树突状细胞是否产生内吗啡肽-1和内吗啡肽-2。用免疫荧光染色研究了内吗啡肽-1和内吗啡肽-2在树突状细胞的表达；用酶免疫测定(EIA)的方法，检测了培养树突状细胞的上清中的内吗啡肽-1和内吗啡肽-2的含量，反映内吗啡肽从树突状细胞的分泌。最后，在证实了树突状细胞表达内吗啡肽-1、内吗啡肽-2和Mu阿片受体的基础上，进一步探讨树突状细胞内吗啡肽/Mu阿片受体的功能意义。用脂多糖(LPS)激活树突状细胞，用naloxone作为阿片受体非特异性拮抗剂，用CTOP作为Mu阿片受体特异性拮抗剂，用竞争结合的方法检测了树突状细胞内由forskolin引起的cAMP的生成：用Western blot的方法，观察了内吗啡肽-1对树突状细胞内磷酸化p38 MAPK和ERK的表达，以判断p38 MAPK和ERK两条信号通路的活化状态；运用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法，检测了内吗啡肽-1促使树突状细胞分泌的细胞因子IL-10、IL-12和IL-23的浓度；在树突状细胞和T淋巴细胞共培养的条件下，用氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入测定的方法检测了T淋巴细胞的增殖能力。 结果：在Mu阿片受体方面，RT-PCR的结果表明，经LPS活化的树突状细胞表达Mu阿片受体的mRNA。免疫荧光双标染色的结果表明，Mu阿片受体蛋白与树突状细胞的CD11c分子共表达于细胞膜上；而且，定量PCR的结果表明，不同的TLR配体均可显著上调Mu阿片受体基因的表达，特别是LPS和Poly(I:C)上调更为明显；LPS活化的树突状细胞在6小时后便出现Mu阿片受体mRNA的表达，表达水平逐步升高，于24小时达到顶峰，并在随后的12-24小时内维持在较高的表达水平。在内吗啡肽方面，免疫荧光染色表明，活化的树突状细胞内产生内吗啡肽-1和内吗啡肽-2；酶免疫测定(EIA)检测的结果表明，不同的TLR配体活化树突状细胞促使分泌不同浓度的内吗啡肽-1和内吗啡肽-2。对内吗啡肽/Mu阿片受体在树突状细胞的功能研究表明，内吗啡肽-1可显著降低胞内forskolin引起的cAMP的生成；能降低p38MAPK信号通路的活化，增加ERK信号通路的活化；相应地，经过内吗啡肽-1处理的LPS活化的树突状细胞，增强IL-10的产生和分泌，降低IL-12和IL-23的产生和分泌；与T淋巴细胞体外共培养时，经内吗啡肽-1或内吗啡肽-2处理的树突状细胞能抑制T淋巴细胞的增殖反应。上述内吗啡肽的作用都能被阿片受体非特异性拮抗剂naloxone和Mu阿片受体特异性拮抗剂CTOP翻转或部分翻转，提示内吗啡肽的作用都是由Mu受体介导的。 结论：活化的树突状细胞诱导性表达Mu阿片受体和内吗啡肽。内吗啡肽可通过Mu阿片受体影响胞内的信号通路，改变树突状细胞的功能特性，调节免疫反应。

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论文说明：缩写词表

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引 言

第一部分：树突状细胞诱导表达Mu阿片受体

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

参考文献

第二部分：树突状细胞产生和分泌内吗啡肽

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

参考文献

第三部分：树突状细胞内吗啡肽／Mu阿片受体的功能意义

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

参考文献

结 论

综述：内吗啡肽调节机体免疫功能的研究进展

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