GKLF基因对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为影响的实验研究

摘要

第一部分GKLF、IKLF在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达及意义
　　 目的：研究胃癌组织和胃癌细胞株中GKLF、IKLF的表达及临床意义。方法：采用荧光实时定量PCR法检测胃癌组织和胃癌细胞株中GKLFmRNA、IKLFmRNA的表达，免疫组织化学法(IHC)检测胃癌组织及其远端正常胃组织中GKLF、IKLF蛋白的表达，Westernblot和免疫细胞化学法(ICC)检测人正常胃上皮细胞株GES-1及胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、HGC-27中GKLF、IKLF蛋白的表达。结果：胃癌组织中GKLFmRNA的相对表达量明显低于远端正常胃组织、IKLFmRNA的相对表达量明显高于远端正常胃组织(P<0.05）、胃癌组织中GKLFmRNA、IKLFmRNA的表达水平与组织分化程度无关，GKLF蛋白总阳性率显著低于远端正常胃组织、IKLF蛋白总阳性率显著高于远端正常胃组织(P<0.05），GKLF、IKLF蛋白表达与胃癌患者的年龄、性别、分化程度、Lauren分型无关，与淋巴结是否有转移及pTNM分期有关(P<0.05)；胃癌细胞株中GKLFmRNA和蛋白的相对表达量低于人正常胃上皮细胞株GES-1、IKLFmRNA和蛋白的相对表达量则高于细胞株GES-1(P<0.05)。结论：胃癌组织和胃癌细胞株中存在GKLF低表达、IKLF高表达，GKLF、IKLF在胃癌发生、发展中起一定的作用，检测GKLF、IKLF的表达有助于判断胃癌患者病情程度和预后。
　　 第二部分重组质粒pcDNA3.1-GKLF的转染及稳定细胞株的建立
　　 目的：建立高表达GKLF的稳定转染细胞株，以进一步观察其对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为的影响。方法：用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1-GKLF转染人胃癌细胞株SGC-7901，通过G418筛选，建立稳定转染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF细胞株，用荧光实时定量PCR法、Westernblot和ICC法检测GKLFmRNA和蛋白的表达。结果：建立了稳定转染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF细胞株，成功地表达目的基因。结论：成功建立稳定转染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF细胞株，为下一步探讨GKLF基因对胃癌生物学行为影响的体内外实验研究奠定基础。
　　 第三部分GKLF基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为影响的体外实验研究
　　 目的：体外观察外源性GKLF基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901增殖活性和侵袭力的影响，探讨GKLF在胃癌中的作用机制。方法：应用MTT法（四甲基偶氮唑蓝比色法）、流式细胞仪、克隆形成实验和体外细胞侵袭实验分别研究GKLF基因转染前、后人胃癌细胞株SGC-7901增殖和侵袭活性的变化。RT-PCR法、Westernblot法分别检测GKLF基因转染前、后人胃癌细胞株SGC-7901中细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、Ki-67、E-钙粘附分子(E-cadherin)mRNA和蛋白的表达。结果：与SGC-7901组和SGC7901-pcDNA3.1组相比，SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组细胞生长速度减慢、细胞出现G0/G1期部分阻滞、克隆形成率低、细胞侵袭力明显减弱(P<0.05）。SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组细胞CyclinD1、Ki-67、E-cadherinmRNA和蛋白的表达水平均低于SGC-7901组和SGC7901-pcDNA3.1组（P<0.05）。结论：GKLF基因可能通过下调CyclinD1、Ki-67、E-cadherin的表达，而使人胃癌细胞株SGC-7901的增殖活性和侵袭力降低。
　　 第四部分GKLF基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为影响的体内实验研究
　　 目的：体内观察外源性GKLF基因转染对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长、转移的影响，并探讨GKLF在胃癌中的作用机制，从而为胃癌的基因治疗提供新的思路。方法：选用36只BALB/C-nu/nu裸鼠进行体内实验，分两批进行。每批裸鼠18只，各随机分为三组，每组分别注射等量的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF、SGC7901-pcDNA3.1和SGC-7901细胞(2×107个/200μl/只)。第一批，将细胞注射于每只裸鼠右胁腹前肢皮下，接种6周后处死裸鼠，观察肿瘤生长状况、成瘤潜伏期，IHC法检测裸鼠皮下移植瘤组织内GKLF、Ki-67、E-cadherin、VEGF蛋白表达情况，测定皮下移植瘤组织中MVD值；同时用B超观察皮下移植瘤大小、血流信号及腹腔内转移情况。第二批，将细胞经尾静脉接种于裸鼠，接种6周后处死裸鼠，显微镜下观察有无肺转移。结果：与SGC-7901组和SGC7901-pcDNA3.1组相比，SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组成瘤潜伏期延长、皮下移植瘤体积和瘤重较小(P<0.05)，皮下移植瘤组织内GKLF蛋白表达升高、Ki-67、E-cadherin、VEGF蛋白表达均降低，微血管密度(MVD)值降低。B超显示：SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组皮下移植瘤较小，血流信号I级。所有裸鼠均未见肺、腹腔转移。结论：GKLF基因可能通过下调Ki-67、E-cadherin、VEGF的表达，从而抑制肿瘤的生长，减少肿瘤中新生血管的生成，以GKLF为靶点的基因治疗有潜在的临床应用前景。