日本血吸虫分子生物学及生物信息学研究与应用

摘要

目的：研究体外培养日本血吸虫成虫细胞,试图引起血吸虫成虫细胞的分裂,寻求引起血吸虫细胞增殖分裂的有效物质,为获得日本血吸虫体外培养无限增殖的细胞系提供参考和依据。模拟自然界的疫水,富集毛蚴并提取毛蚴基因组DNA,建立一种灵敏、特异的痕量检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法。研究日本血吸虫DNA序列片段的2-D图形表示和3-D图形表示,从不同角度反映隐藏在DNA序列中的生物学上的特征,来寻找所隐藏的生物学的基本规律,为下一步在生物学的实验中验证规律,指导实验,并发掘更深层次生命的本质奠定基础。
　　 方法：取感染7～8w日本血吸虫的小鼠,颈椎脱臼法处死,无菌条件下挑取日本血吸虫成虫若干条,以20条为一组,剪碎后用改良日本血吸虫细胞体外培养方法培养,Olympus倒置显微镜下拍照记录实验结果。随机抽取两个培养瓶离心收集细胞,制备日本血吸虫染色体,Olympus-CX31显微镜下观察,鉴定日本血吸虫成虫细胞的存活状况。把培养瓶随机分为三组,分别向其中加促细胞分裂物质bFGF,IL-2和Con A,并对培养瓶依次做标记,放在相同的环境和条件中进行培养,定点定位连续观察体外培养日本血吸虫成虫细胞的生长状况,并用Olympus数码相机在Olympus倒置显微镜下进行显微摄影。
　　 取感染6～8w日本血吸虫的小鼠肝脏,碾磨后沉淀,孵化并利用间接连续离心法富集毛蚴,采用蛋白酶K-苯酚法提取毛蚴基因组DNA。登陆GenBank查询获得日本血吸虫保守序列18S小亚基单位核糖体脱氧核酸(18S rDNA)基因,利用引物设计软件Primer Premier5.0和Oligo6自主设计一对引物,建立水体检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法。梯度稀释血吸虫毛蚴基因组DNA进行PCR方法的灵敏性试验,设置阴性对照,PCR产物通过电泳鉴定。
　　 选取平面直角坐标系的两个坐标轴的4个方向分别代表4种核苷酸碱基来作DNA序列片段的2-D图形表示。画出相互间隔一个单位的4条水平线,并让A,C,G,T这4种碱基分别与这4条水平线对应,对应碱基描点,用直线连接所有相邻的点,最终得到DNA序列片段的“四水平线”图。将4个三维空间中的向量分别赋予DNA序列的4种碱基:(1,0,0)→A,(0,1,0)→C,(0,0,1)→G和(1,1,1)→T。根据向量来制作DNA序列片段的点的坐标。再用直线连接相邻的点而得到DNA序列片段的3-D曲线。最后将DNA序列片段的3-D曲线投影到2维平面,比较其形状并进行分析。找出DNA序列的特征序列,构建基于特征序列的DNA序列片段的“双水平线”图。构建DNA序列片段的有向图,作图方法同前面的DNA序列片段的2-D图形表示一样,只不过在连接相邻的点时用的是有向箭头而非线段。
　　 结果：(1)血吸虫成虫细胞在Olympus倒置显微镜下呈球形、色泽鲜亮,不添加任何促细胞分裂物质的情况下,细胞数量起初随时间的增长而有所增多。但随着时间进一步推移,观察定位的血吸虫细胞却“不增殖、不传代”,几乎很难看到细胞密度的明显变化。制备日本血吸虫染色体,在油镜下观察,发现随机抽取的两瓶细胞均存在分裂中期相,并且染色体数目n=8。不同的促细胞分裂物质对血吸’虫成虫细胞的影响不完全相同。添加bFGF的血吸虫细胞增殖并不明显,而添加IL-2和Con A的血吸虫细胞个数明显增多。其中,添加IL-2的血吸虫细胞增殖个数最多,最为明显。
　　 (2)PCR扩增日本血吸虫毛蚴得到特异性DNA片段,片段长度为463bp,阴性对照组无扩增产物。PCR法可检测出日本血吸虫毛蚴DNA的最低浓度为62.5pg/μL。
　　 (3)依次得到了DNA序列片段的2-D图形表示、“四水平线”图、3-D曲线、“双水平线”图和DNA序列片段的有向图,并进行比较分析。
　　 结论：在不添加任何促细胞分裂物质的情况下,日本血吸虫成虫细胞体外培养“不增殖、不传代”,几乎很难看到细胞密度的明显变化；促细胞分裂物质bFGF对日本血吸虫成虫细胞的增殖没有明显促进作用,而IL-2和Con A对日本血吸虫成虫细胞的增殖有明显促进作用,并且IL-2的促进作用最为明显。建立的水体检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法灵敏、特异,具有一定的预警作用。DNA序列片段的2-D图形表示和3-D图形表示能从不同角度反映隐藏在DNA序列中的生物学上的特征。DNA序列片段的2-D图形表示由于简并现象导致信息丢失,但DNA序列片段的3-D曲线却避免了因与自身相交或重叠而导致的简并现象。DNA序列片段的有向图表示的简并度比相应无向图的低得多,甚至在某些时候下将不再出现简并现象。而且,在有向图中,我们所看到的实际上正是沿着生物序列“游走”时的“历史”。因此,有向图更容易激发人们的形象思维,从而有利于人们迅速地抓住生物序列的特征。