有机磷农药诱导后家蚕脂肪体特征蛋白及其基因的表达分析

摘要

近年来，随着人类基因组计划的顺利进行和完成，生命科学的研究进入了后基因组时代。在这一时代，生命科学的主要研究对象已经从基因组学研究逐渐向功能基因组学、蛋白质组学和细胞代谢组学等研究转移。蛋白质组学分析技术已被广泛应用于生物创新研究，成为功能基因组学中最重要的核心技术之一。蛋白质组学是一门在整个细胞水平甚至整体水平上研究各种蛋白质的性能，如表达水平、翻译后修饰等，以便在蛋白质水平上获得一个细胞和调控网络的总体的生理生化进程。蛋白质组学技术也适用于同时进行数百甚至数千种蛋白质的分析。随着有机磷杀虫剂在农作物和人类生活害虫防治中的广泛应用，导致大量害虫产生了抗药性。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫的模式生物，由于家蚕与鳞翅目害虫在生理生化及农药代谢机制方面具有相似性，对家蚕进行有机磷农药抗性的研究，将为鳞翅目害虫的防治和家蚕抗性品种的选育提供一定的理论依据。本文以家蚕品种大造为研究材料，测定了有机磷农药辛硫磷对5龄3d雌雄家蚕的毒力，通过比较家蚕在有机磷农药诱导和未诱导情况下脂肪体蛋白质的表达谱，获得家蚕脂肪体与辛硫磷抗性相关蛋白，结合质谱分析技术，鉴定差异表达蛋白，继而采用半定量RT-PCR方法研究该蛋白的基因转录水平。获得的主要结果如下：
　　 1辛硫磷对大造品种5龄3d雌雄家蚕的致死中量测定
　　 用不同浓度梯度的辛硫磷药液处理雌雄分开饲养的5龄3d家蚕，分别测定雌雄家蚕的辛硫磷致死中量，结果表明，雌性家蚕LC50为3.932~4.184μg/mL，雄性家蚕LC50为3.989~4.219pg/mL，雄性家蚕的抗性略高于雌性家蚕。为之后的取材工作提供了一定的理论依据。
　　 2雄性家蚕在有机磷农药诱导下脂肪体蛋白的表达谱研究
　　 2.15龄3d雄蚕在有机磷农药诱导后脂肪体双向电泳图谱的建立
　　 采用蛋白质双向电泳技术对有机磷农药辛硫磷诱导后的5龄3d雄蚕脂肪体的蛋白质组分进行比较分析。结果表明，对照组共检测到465个蛋白点，诱导实验组检测到396个蛋白点，其中能匹配的蛋白点有348对，匹配率为73.54％，蛋白点主要分布在分子质量20.1~66.4kD、等电点5~8的范围内。
　　 2.25龄3d雄蚕在有机磷农药诱导下脂肪体差异蛋白的质谱鉴定
　　 将分析所得到的差异表达蛋白进行了基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)分析，已鉴定的蛋白包括家蚕磷酸丝氨酸转氨酶(SerB)和家蚕甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。这2个蛋白分别涉及不同的代谢途径，如丝氨酸生物合成途径、丝氨酸代谢途径、糖酵解途径、糖原异生途径、核苷酸代谢途径等。
　　 2.3辛硫磷诱导后5龄3d雄蚕各组织中SerB基因的转录活性
　　 采用半定量RT-PCR方法检测辛硫磷诱导后5龄3d雄蚕幼虫脂肪体等6种组织器官中SerB基因的mRNA转录水平。经辛硫磷诱导后，在脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管组织器官中，SerB基因mRNA的相对表达量分别比对照组上调183%、4.48%、9.55%、2.6%、1.88%、15.25%，其中脂肪体中SerB基因的表达上调与蛋白的表达上调一致。
　　 3雌性家蚕在有机磷农药诱导下脂肪体蛋白的表达谱研究
　　 3.15龄3d雌蚕在有机磷农药诱导后脂肪体双向电泳图谱的建立
　　 采用蛋白质双向电泳技术对有机磷农药辛硫磷诱导后的5龄3d雌蚕脂肪体的蛋白质组分进行比较分析。结果表明，对照组共检测到516个蛋白点，诱导实验组检测到457个蛋白点，其中能匹配的蛋白点有409对，匹配率为70.25%，蛋白点主要分布在分子质量20.1~66.4kDa、等电点5~8的范围内。
　　 3.25龄3d雌蚕在有机磷农药诱导下脂肪体差异蛋白的质谱鉴定
　　 将分析所得到的差异表达蛋白进行了MALDI-TOFMS分析，已鉴定的蛋白包括家蚕热休克蛋白/热激蛋白(HSP)和家蚕磷酸甘油醛异构酶/磷酸丙糖异构酶(TPI/TIM)。这2个蛋白分别涉及不同的代谢途径，如参与糖酵解过程，调节ATP敏感的钾离子通道，催化丙糖磷酸异构体在二羟丙酮磷酸和D型甘油醛-3-磷酸之间转换，调节Na+-K+-ATP酶的活性，促进细胞内糖原异生和糖原生成的作用。
　　 家蚕属鳞翅目蚕蛾科昆虫，国内外不少学者对家蚕的农药抗性进行了较多的研究，但从蛋白质组水平对家蚕有机磷农药抗性的研究较少，筛选出与家蚕对有机磷农药抗性相关的蛋白至今未见报道。本研究初步鉴定出有机磷农药诱导后家蚕脂肪体的4个特征蛋白，推测这些蛋白可能在家蚕对有机磷农药代谢解毒过程的某些环节中发挥了一定的作用，本研究结果对于研究家蚕对化学农药的敏感性具有重要意义，为家蚕的抗性品种选育和开发针对鳞翅目害虫的高效杀虫剂奠定了理论基础，为鳞翅目害虫的防治提供了一定的理论依据。