家蚕在菊酯类农药诱导后的脂肪体蛋白表达谱研究

摘要

家蚕不仅是重要的经济昆虫，还是鳞翅目重要的模式昆虫。粮食作物和森林害虫绝大多数属于鳞翅目，通过对家蚕生理、病理，遗传等的研究，可从根本上消除虫害的威胁，在粮食作物和森林害虫防治上取得新突破。昆虫的脂肪体是其体内的一种重要组织，它既是糖、脂和蛋白质代谢的中心，又是主要激素作用的靶组织，还具有贮存排泄和解毒等生理功能。
　　 目前的鳞翅目害虫抗药性基因方面研究的日益深入，国内开展了对家蚕各组织蛋白质组水平上的相关研究，但是从蛋白质水平上研究家蚕对农药的抗性机制还未见相关报道。本文研究了家蚕在菊酯类农药诱导前后脂肪体蛋白质的表达谱特征，获得家蚕对氯氰菊酯抗性相关蛋白，采用质谱分析技术，鉴定了差异蛋白。在此基础上采用了半定量RT-PCR方法，研究特征蛋白的基因转录水平特征，获得的研究结果如下：
　　 1家蚕雌雄个体对氯氰菊酯的致死中量测定
　　 用不同浓度的氯氰菊酯农药点滴家蚕的雌雄个体，测定了不同性别的家蚕致死中量(LD50)。结果表明，雄蚕的LD50为56.336ng、雌性的LD50为49.557ng，雄性家蚕个体的抗药性略高于雌性家蚕，为家蚕雌雄个体对农药的抗性研究打下基础。
　　 2雄性家蚕在菊酯农药诱导后脂肪体蛋白的表达谱研究
　　 2.1雄性家蚕在菊酯农药诱导后脂肪体双向电泳图谱建立
　　 用蛋白质双向电泳技术对菊酯类农药诱导后的雄性家蚕脂肪体蛋白质组分的比较分析。结果表明，对照组共检测到432个蛋白点，诱导实验组检测到369个蛋白点，其中能匹配的蛋白点有342对，匹配率为76.68％，蛋白点主要分布在分子质量20.1-66kD、等电点4-8之间。
　　 2.2雄性家蚕在菊酯农药诱导后脂肪体差异蛋白质谱鉴定
　　 将分析出的差异蛋白进行了基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析，已鉴定的蛋白分别为家蚕伴侣素、线粒体醛脱氢酶、烯醇酶、肌动蛋白、gag-like蛋白。这些蛋白分别涉及不同的代谢途径，如蛋白质折叠、呼吸链反应、糖酵解途径、微管组装等。
　　 2.3氯氰菊酯诱导家蚕5龄幼虫烯醇酶基因的转录活性
　　 采用半定量RT-PCR方法，检测氯氰菊酯诱导家蚕5龄幼虫中肠等7种组织器官中烯醇酶基因mRNA的转录水平。经氯氰菊酯诱导后在脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管、血液等组织器官，烯醇酶基因mRNA表达量比对照分别下调了13.79%、10.71%、22.48%、7.40%、27.00%、11.50%、14.52%，其中脂肪体的烯醇酶基因表达和蛋白的表达下调一致。
　　 3雌性家蚕在菊酯农药诱导后脂肪体蛋白的表达谱研究
　　 3.1雌性家蚕在菊酯农药诱导后脂肪体双向电泳图谱建立
　　 用蛋白质双向电泳技术对菊酯类农药诱导后的雌性家蚕脂肪体蛋白质组分的比较分析。结果表明，对照组共检测到758个蛋白点，诱导实验组检测到675个蛋白点，其中能匹配的蛋白点有554对，匹配率为72.84%，蛋白点主要分布在分子质量20.1-66kD、等电点4-8之间。
　　 3.2雌性家蚕在菊酯农药诱导后脂肪体差异蛋白质谱鉴定
　　 将分析出的差异蛋白进行了基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析，已鉴定的蛋白分别为家过氧化氢酶、肌动蛋白、细胞色素p450蛋白、未知蛋白反转录转座子热点蛋白等。这些蛋白分别涉及不同的代谢途径，可能与家蚕的抗性相关。
　　 本研究分析了不同性别家蚕经菊酯类农药诱导后的表达谱，发现了相关的差异蛋白，经质谱鉴定后差异蛋白包括醛脱氢酶，烯醇酶，过氧化氢酶，细胞色素p450等，丰富了家蚕蛋白质组数据库。这些酶类涉及不同的代谢机制，可能与菊酯类农药抗性相关，这不仅对家蚕的菊酯类农药抗性机制的研究具有重要的理论依据，也为害虫的生物控制提供了一个参考。