细胞角蛋白-20单克隆抗体制备及在大肠癌检测中的初步应用研究

摘要

目的:制备抗细胞角蛋白-20单克隆抗体,应用该抗体研究检测临床大肠癌患者外周血标本中细胞角蛋白-20的表达情况,对临床大肠癌的辅助诊断提供科学依据。
　　 方法:通过逆转录方法获得人细胞角蛋白-20的cDNA,基因扩增后将其插入原核表达载体pET28a,经酶切、测序鉴定、获得正确克隆后,将重组质粒转化BL21(DE3)细菌。在一定温度和一定浓度IPTG的诱导条件下,表达细胞角蛋白-20,用NTA-Ni柱纯化,获得细胞角蛋白-20。用细胞角蛋白-20免疫Balb/c小鼠,加强免疫后检测免疫效果,进行脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合,筛选克隆,制备抗细胞角蛋白-20的单克隆抗体。采用ELISA和Western Blot方法对获得的单抗进行鉴定,获得特异性单抗后,用抗细胞角蛋白-20的单克隆抗体制备简易细胞角蛋白.20酶联免疫检测试剂盒。对10份正常人及40份大肠癌患者的临床血液标本进行了检测。
　　 结果:获得pET28a-CK20重组质粒,表达纯化了细胞角蛋白-20,获得了3株特异性抗细胞角蛋白-20的单克隆抗体,成功制备了简易检测细胞角蛋白-20的酶联免疫试剂盒。对10份正常人及40份大肠癌患者的临床血液标本的检测结果提示:正常人的标本呈阴性,大肠癌患者标本中有19例呈阳性,检出率为47.5％,并且均属于Dukes分级的B、C、D期,三期中的检出率分别为25％、41.7％、84.6％(3/12、5/12、11/13)。40例大肠癌患者标本组与正常对照组相比有显著的统计学差异(P<0.05)。Dukgs C期、D期和A期、B期相比具有统计学差异(P<0.05)。
　　 结论:本研究在原核表达系统中成功表达和纯化了细胞角蛋白-20,成功制备了抗细胞角蛋白-20的单克隆抗体,获得3株高效价的单克隆抗体,制备了简易的检测细胞角蛋白-20酶联免疫检测试剂盒。用自制的细胞角蛋白-20酶联免疫检测试剂盒对10份正常人及40份大肠癌患者的临床血液标本进行了检测。结果提示,细胞角蛋白-20可作为除CEA肿瘤标志物外的另一个参考指标,通过检测患者外周血中的细胞角蛋白-20,可以快速检测及识别高危患者,有助于监测肿瘤发展及预后。