上调Fas表达增强前体T淋系肿瘤细胞体外凋亡敏感性及抑制其动物体内肿瘤形成

摘要

目的:
　　 近年来我国恶性淋巴瘤的新发率呈逐年上升趋势，其上升速度超过其他恶性肿瘤而高居首位，严重威胁着我国人民的身体健康。前体T淋系肿瘤即T淋巴母细胞性急性白血病/淋巴瘤(T-cell acute lymphoblastic leukemia/lymphoblastic lymphoma，T-ALL/LBL)在恶性淋巴瘤疾病中占有一定比例，其恶性程度高，侵袭性强，进展速度快，目前已有的放疗、化疗、造血干细胞移植等治疗方法尚不能取得令人满意的效果，探索新的有效的治疗前体T淋系肿瘤的方法是一项亟待解决的医学任务。作为新兴的从分子水平解决疾病问题的治疗手段，基因治疗极有希望成为继手术、放疗、化疗之后新一代更为有效的肿瘤治疗手段。FS7相关细胞表面抗原(FS7-associated cellsurface antigen，Fas)是启动细胞外部凋亡途径的重要的细胞表面死亡受体(deathreceptor，DR)之一，其介导的凋亡通路是T淋巴细胞在正常生理状态下进行凋亡的主要途径，在维持T淋巴细胞数量稳定方面发挥着重要作用，研究发现Fas缺陷参与多种良性及恶性T淋巴细胞增殖类疾病的发生发展过程。基于以上事实，我们就基因转染上调Fas表达对T淋系肿瘤细胞体外凋亡以及体内肿瘤形成的影响进行了相关研究，试图探索一种新的有效的用于前体T淋系肿瘤的基因治疗方法。
　　 方法:
　　 扩增目的基因：在本人知情同意情况下，采集一名健康志愿者外周抗凝血5ml，经密度梯度离心法从中分离得到单个核细胞，应用Trizol试剂将单个核细胞充分裂解后经氯仿、异丙醇等处理提取总RNA，将总RNA经逆转录酶等作用后逆转为总cDNA，应用相应引物经PCR技术扩增得到包含kozak及全部外显子在内的正常人Fas基因序列，将PCR产物进行凝胶电泳、割胶回收并纯化得到目的基因。构建真核表达载体：将目的基因装入pMD-18T载体转化至感受态细胞DH5α，进行扩增克隆后提取质粒，应用相应引物经PCR从该质粒扩增目的基因Fas，经内切酶及连接酶将其装载至真核表达载体质粒pCDNA3.1(+)，构建pCDNA3.1(+)-Fas质粒，对其进行测序，将结果与Genbank M67454序列进行对比。稳定转染细胞：将真核表达质粒pCDNA3.1(+)-Fas转染至人急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，R-ALL)细胞株Jurkat细胞内，应用含500mg/L浓度G418的培养液进行筛选，筛选后存活细胞继续用含250mg/L浓度G418的培养液进行培养传代，建立稳定转染有正常人Fas基因的Jurkat-Fas细胞株。检测Jurkat细胞和Jurkat-Fas细胞中Fas基因表达水平差别：分别提取两种细胞的总RNA，经逆转录合成总cDNA，应用相应引物经PCR分别扩增两细胞株的目的基因Fas及看家基因GAPDH，将PCR产物进行凝胶电泳后在紫外光下成像，依据DNA标记定性判断两细胞株中Fas基因表达情况；应用针对Fas基因和GAPDH基因的相应引物分别将两细胞株进行定量PCR检测，定量判断两细胞株中以GAPDH基因为基准的Fas基因的相对定量表达情况，重复实验操作三次，结果以均数士标准误形式表示。检测Jurkat细胞和Jurkat-Fas细胞中Fas蛋白表达水平差别：应用PE标记的抗人Fas抗体分别对两种细胞进行避光染色，PBS液洗涤后在488nm波长光下应用共聚焦显微镜观察细胞Fas蛋白表达情况；分别应用PE标记的抗人Fas抗体和PE标记的鼠IgGlκ对两种细胞进行避光染色，PBS液洗涤后应用流式细胞仪检测荧光强度，定量判断两细胞株中以鼠IgGlκ同型对照为基准的Fas蛋白的相对定量表达情况，重复实验操作三次，结果以均数土标准误形式表示。检测Jurkat细胞和Jurkat-Fas细胞体外凋亡敏感性的差别：应用含人可溶性Fas配体(Fas ligand，FasL)25ng/ml的培养液处理两种细胞，分别收集处理0小时、12小时、24小时三个时间点的两种细胞，应用Alexa Fluor()488 annexin V和碘化丙啶(propidium iodide，PI)避光染色，PBS液洗涤后应用流式细胞仪检测凋亡率，重复实验操作三次，结果以均数±标准误形式表示。检测Jurkat细胞和Jurkat-Fas细胞在裸鼠体内形成肿瘤的差别：将8只4周龄BALB/c雄性裸鼠经全身亚致死剂量射线照射后平均随机分为两组，分别在裸鼠左上肢腋窝处皮下注射5×107的Jurkat细胞和Jurkat-Fas细胞，自注射细胞后7天始，所有裸鼠每7天通过尾静脉注射人可溶性FasL一次，每4天测量一次肿瘤大小，观察肿瘤生长情况40天。统计两组裸鼠肿瘤生长大小，结果以均数±标准误形式表示。
　　 结果:
　　 成功构建含目的基因的真核表达质粒：真核表达质粒pCDNA3.1(+)-Fas中针对Fas基因的测序结果经对比与Genbank M67454序列完全一致，标志目的基因正常人Fas基因被成功克隆。Jurkat-Fas细胞内Fas mRNA水平较Jurkat细胞内Fas mRNA水平明显增高：两细胞株中Fas mRNA经RT-PCR扩增凝胶电泳成像示，200-300bp区域内均可见GAPDH基因的清晰条带，而在1000-1500bp区域内，Jurkat-Fas细胞处可见Fas基因的清晰条带，而Jurkat细胞处未能见到明显的Fas基因清晰条带；两细胞株中Fas mRNA经实时定量PCR检测结果示Jurkat-Fas细胞的Fas mRNA水平明显高于Jurkat细胞的Fas mRNA水平，P=0.0007，前者大约是后者的二倍。Jurkat-Fas细胞内Fas蛋白水平较Jurkat细胞内Fas mRNA水平明显增高：两细胞株细胞表面Fas蛋白经共聚焦显微镜观察图像示Fas蛋白表达于细胞表面，Jurkat-Fas细胞表面的Fas蛋白较Jurkat增多；Jurkat和Jurkat-Fas细胞表面Fas蛋白经流式检测结果示Jurkat-Fas细胞的Fas蛋白明显高于Jurkat细胞的Fas蛋白水平，P<0.0001，前者大约是后者的二倍。FasL处理下Jurkat-Fas细胞凋亡率较Jurkat细胞凋亡率明显增高：FasL处理12小时，Jurkat-Fas细胞的凋亡率大约是Jurkat细胞凋亡率的3倍，前者较后者明显增高，P=0.0012；FasL处理24小时，Jurkat-Fas细胞的凋亡率大约是Jurkat细胞凋亡率的4倍，前者较后者明显增高，P<0.0001。FasL处理下Jurkat-Fas细胞体内肿瘤形成能力较Jurkat细胞体内肿瘤形成能力明显降低：在FasL处理下，24天后接种Jurkat细胞的4只裸鼠开始在注射部位出现肿瘤并稳定生长，而另外接种Jurkat-Fas细胞的4只裸鼠在观察期内无一出现肿瘤生长。过表达Fas明显抑制了前体T淋系肿瘤在体内的生长，第24天时间点上，P=0.0048；第28天时间点上，P=0.0022；第32天时间点上，P<0.0001；第36天时间点上，P=0.0002；第40天时间点上，P=0.0004。
　　 结论:
　　 在本研究中，我们通过向人急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat稳定转染正常人Fas基因建立了一株过表达Fas的细胞Jurkat-Fas，两细胞间的比较证明Fas蛋白的表达与Fas mRNA水平呈平行关系。在可溶性人FasL处理下，Jurkat-Fas细胞的体外凋亡率较Jurkat细胞明显增高，其凋亡敏感性与Fas mRNA水平、Fas蛋白水平呈平行关系。在可溶性人FasL处理下，Jurkat-Fas细胞在裸鼠体内的肿瘤形成能力较Jurkat细胞明显减低，其肿瘤生长能力与Fas mRNA水平、Fas蛋白水平呈负相关关系。由此可见，通过Fas基因转染上调Fas蛋白表达有可能成为一种新的有效的治疗前体T淋系肿瘤的基因治疗方法，要实现该方法在临床上的运用，还需要进一步研究如何避免Fas介导的细胞增殖作用、Fas凋亡通路中调节蛋白对该通路的影响以及Fas转染的靶向性等相关问题。