Real-time PCR检测水体日本血吸虫尾蚴和小鼠感染早期检测的研究

摘要

目的：(1)比较日本血吸虫DNA重复序列psjrh1．0(U92488．1)、18S小亚基单位核糖体核酸基因(18SrRNA)序列(AY157226．1)和sjR2的G55A声隆(AF412221．1)在基因组中的丰度，初步确定SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR(RQ—PCR)方法检测日本血吸虫的较适宜靶基因和反应条件。(2)建立SYBRGreenⅠ荧光RQ—PCR检测水体中日本血吸虫DNA的方法，作DNA浓度对数和初始循环数(Ct值)的标准曲线，评价方法的可靠性。(3)定量检测水体中日本血吸虫尾蚴，作尾蚴数的对数和Ct值的标准曲线，评估水体中日本血吸虫尾蚴的数量。(4)比较RQ—PCR法与ELISA法的早期检测日本血吸虫尾蚴感染的效果，选择较好的早期诊断方法。
　　 方法：(1)设计常规PCR引物，建立温度梯度PCR，并对扩增产物进行测序，确定保守序列。(2)根据测序结果，针对三个重复序列的保守序列设计RQ—PCR引物，通过建立温度梯度和浓度梯度RQ—PCR，确定丰度较高的靶序列。(3)在较适宜的反应条件下，作日本血吸虫DNA浓度对数和Ct值的标准曲线，得到相关系数。(4)绘制日本血吸虫尾蚴数量和Ct值的标准曲线，得到相关系数。(5)分别用ROSE法和全基因组提取试剂盒提取5、10和20条尾蚴感染第2、4、6、8和15天的小鼠血清中DNA，用RQ—PCR进行检测；用ELISA法检测第1、2、3和4w感染尾蚴的小鼠血清中抗日本血吸虫虫体抗原的IgG，确定可检测到小鼠感染日本血吸虫尾蚴的最早时间。
　　 结果：(1)普通PCR产物进行琼脂糖凝胶电脉，表明：psjrh1．0和18SrRNA在退火温度57．4℃下，引物浓度为20pmol时，反应体系较佳；G55A在退火温度58．8℃下，引物浓度为20pmol时，反应体系较佳。对其测序结果表明：psjrh1．0的产物与NCBI发表序列比较，只有一个碱基不同；18SrRNA的产物与NCBI发表序列比较，完全相同；而G55A的变异性较大，与NCBI发表序列比较，有20多个碱基不同。(2)设计荧光RQ—PCR引物，扩增片段约为160bp，温度梯度PCR表明：三个重复序列的最佳反应条件为退火温度58℃；与18SrRNA和G55A比较，psjrh1．0在基因组中的丰度最高。(3)以psjrh1．0为靶序列建立RQ—PCR可检测到日本血吸虫成虫基因组DNA的浓度为2fg，用配套软件绘制2fg～2×108fg的标准曲线，相关系数为0．9977，而对DNA为0．2fg的浓度下和阴性对照双蒸水的检测结果为阴性。重复实验表明，其变异系数小于2％，可靠性很好。(4)分别提取1、5、10、20和80条日本血吸虫尾蚴的DNA，建立尾蚴条数的对数和Ct值的标准曲线，其相关系数为0．9186，相关性良好。重复实验和标准曲线的变异系数都小于3％，可靠性良好。(5)对ROSE法和试剂盒法提取感染小鼠血清中DNA的检测结果表明：ROSE法较试剂盒法的检测阳性率更高。感染10条尾蚴的小鼠第2w的检测结果为阳性，而用ELISA法检测第4w仍为阴性。
　　 结论：RQ—PCR较普通PCR方法具有更高的检测精度，特异性高，可靠性好；以psjrh1．0为靶基因建立的荧光PCR方法可检测到2fg的日本血吸虫DNA，DNA浓度的对数和Ct值具有良好的线性关系，尾蚴数的对数和Ct值具有良好的线性关系，且可靠性良好，Ct值能够准确反应尾蚴的数量。本方法建立的RQ—PCR具有较好的早期诊断效果和临床应用价值。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 日本血吸虫基因组内三种多重复序列丰度的比较

第二部分 SBRY Green Ⅰ实时定量PCR定量检测水体中尾蚴方法的建立及效果评价

第三部分 以小鼠为模型的日本血吸虫病的检测

结论

参考文献

综述:实时定量PCR的特点及其研究寄生虫方面的应用

参考文献

攻读学位期间发表的论文

缩略词表

致谢