一个遗传性血管性血友病家系的实验室诊断和分子发病机制研究

摘要

血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)是由于血管性血友病因子(vonWillebrand fcator，VWF)缺乏或功能异常所致的出血性疾病。根据发病原因分为遗传性和获得性两大类。遗传性血管性血友病主要为常染色体显性遗传，少数为隐性遗传。遗传性vWD的不同分类及亚型分型具有不同的分子发病机制。研究该病的分子发病机制，有助于了解VWF蛋白的结构与功能的关系，对于临床诊断、治疗和预后都有重要的意义。
　　 目的：采用一系列vWD诊断实验、分型实验，对一个出血性疾病患者及其家系明确诊断，并对先证者及家系受累成员的血管性血友病因子(VWF)基因进行分析，探讨其发病机制。
　　 方法：
　　 一)应用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集实验(Ristocetin Induced Platelet Aggregation，RIPA)及VWF多聚体电泳等方法分析vWD患者家系三代6位成员临床表型。
　　 二)PCR扩增先证者及家系成员的VWF基因的52个外显子及其侧翼序列并测序，通过Chromas软件将测序结果与NM_000552.3序列进行比对。根据检测到的突变位点，以含VWF全长cDNA的表达质粒(pSVVWF)为模板，采用定点突变的方法构建突变质粒pSVVWFdel6。将野生型VWF质粒(wt-pSVVWF)和突变型VWF质粒(pSVVWFdel6)转染HEK293细胞。收集瞬时转染后的上清和细胞裂解液。转染后的上清以40倍的比例浓缩。ELISA法检测细胞上清及细胞裂解液中VWF抗原含量，并采用多聚体电泳法对细胞上清进行VWF多聚体分析。
　　 结果：
　　 1、先证者的血浆VWF：Ag为20.5％，血浆FVIII：C为25.0％，VWF：RCo为6.2％，RIPA为28.5％，VWF：CB为3.8％，以上结果均明显低于正常参考值。血浆VWF多聚体分析显示大分子量多聚体缺乏，而血小板VWF多聚体分析无异常。同时先证者VWF：Ag/VWF：CB>2，这与以往报道相一致。
　　 2、与先证者有相似症状的四位家系成员的血浆VWF：Ag、VWF：RCo、FVIII：C、RIPA、VWF：CB均明显低于正常范围，同时血浆VWF多聚体分析显示大分子量多聚体缺乏，血小板VWF多聚体分析无异常。
　　 3、先证者的VWF基因52个外显子及其侧翼序列扩增测序，发现第28号外显子存在杂合的6个碱基GATGTG的缺失，导致VWF A2区的氨基酸D1529-V1530缺失，其四位受累家系成员测序结果也有相同的基因的改变。为确定所发现的VWF基因缺失这一改变属基因突变还是基因多态性，我们共检测了68位正常人的VWF基因的第28号外显子基因，未见该基因改变。
　　 4、野生型及突变型VWF表达载体转染HEK293细胞后，检测细胞裂解液中VWF抗原含量，突变型与野生型无明显差异；而细胞培养上清中，单转突变体的细胞上清VWF含量显著降低，约为野生型的26.89±4.64％，共转突变型和野生型的细胞上清中VWF含量也显著降低，为野生型的37.83±5.29％，VWF多聚体分析突变型浓缩上清中VWF大分子量多聚体缺如。
　　 结论：
　　 1、根据先证者及受累家系成员临床症状、体征以及VWF相关实验室检查，可明确诊断为2A型vWD。
　　 2、基因分析发现先证者及其他4位家系成员的VWF A2结构域内一杂合的6个碱基GATGTG的缺失，从而导致氨基酸D1529-V1530缺失，该突变国内外未见报道，为新发现的基因突变。
　　 3、体外细胞水平研究提示，VWF D1529-V1530缺失影响VWF的多聚化及分泌，从而影响VWF的功能，为该家系的分子发病机制。