氯胺酮对PC12细胞增殖的影响及其机制研究

摘要

目的:探讨氯胺酮对PC12细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用及其机制。
　　 方法:以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(pheochromocytoma cell,PC12)为多巴胺能神经元的细胞模型,以不同浓度的氯胺酮分别加入培养的PC12细胞中各自培养不同时间后,用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞的增殖活性；不同浓度的氯胺酮加入PC12细胞培养48h后以流式细胞仪(PI单染和AnnexinV-FITC双染)检测其细胞凋亡率和细胞周期变化情况；Hoechst染色观察PC12细胞凋亡的形态,透射电镜观察PC12细胞超微结构的改变； RT-PCR检测Bax、Bcl-2、caspase9、caspase3基因mRNA的表达以及Western blot检测Bax、Bcl-2和酪氨酸羟化酶(TH)的蛋白表达。
　　 结果:(1)MTT检测结果显示:0.9 mmol／L的氯胺酮作用PC12细胞12 h、24h、48 h后的抑制率分别为13.36％、40.13％和42.02％；1.2mmol／L氯胺酮作用PC12细胞12 h,24 h,48 h,后的抑制率分别为17.14％、41.8％和60.72％；1.5 mmol／L氯胺酮作用PC12细胞12 h,24 h,48 h后的抑制率分别为36.26％、58.76％和80.04％。12 h、24 h、48 h的氯胺酮IC50分别为:1.659 mmol／L、1.261 mmol／L和1.182 mmol／L,提示氯胺酮对PC12细胞的抑制作用呈时间及剂量依赖趋势；(2)Hoechst荧光染色可观察到氯胺酮给药组部分细胞核体积变小,荧光强度增强,部分呈碎块状致密浓染,颜色发白,且随着浓度的增加,凋亡的细胞增多,而对照组细胞核较大,核大小及染色均匀、染色较浅；(3)流式细胞仪PI单染结果显示:0、0.9、1.2、1.5 mmol／L氯胺酮作用于PC12细胞48h后,细胞凋亡率分别为2.52％、6.53％、8.61％、19.77％,与对照组相比差异显著(P<0.01)。细胞周期检测结果:对照组S期细胞占17.05％,0.9、1.2、1.5mmol／L的氯胺酮作用PC12细胞48h后,S期细胞所占比例分别为21.59％、25.81％、29.07％,与对照组相比,有统计学意义(P<0.05),提示氯胺酮可使细胞周期阻滞在S期；(4)AnnexinV-FITC双染进一步检测凋亡率显示:0.9、1.2、1.5 mmol／L的氯胺酮作用PC12细胞48h后,细胞凋亡率分别为8.2％、12.5％、14.5％,而对照组的凋亡率为1.2％,差别有统计学意义(P<0.05):(5)RT-PCR检测结果:0、0.9、1.2、1.5 mmol／L氯胺酮处理PC12细胞48h之后,线粒体信号通路相关的bax、caspase9及caspase3 mRNA表达显著增加,Bcl-2 mRNA的表达显著减少(P<0.05)且均呈一定的剂量依赖趋势。(6)Western blot检测结果:bax蛋白表达上调,bcl-2和酪氨酸羟化酶蛋白(TH)表达下调,且均呈一定的剂量依赖趋势(P<0.05)。
　　 结论:氯胺酮可抑制PC12细胞增殖,呈浓度依赖趋势,该作用可能与使细胞周期阻滞在S期有关；并可诱导PC12细胞凋亡,线粒体信号通路的激活可能是其分子机制之一。