IKK2dn转染未成熟树突状细胞诱导产生的CD4+CD25-T细胞的筛选及功能鉴定

摘要

目的：建立一种稳定的大鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cells，DC)的体外培养方法，用IKK2dn转染未成熟树突状细胞(immature dendritic cells，imDC)并负载供者抗原，用其与受者T细胞进行体外混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)诱导产生调节性T细胞(T-regulatory cells，Treg)，从Treg中筛选出高活性高纯度的CD4+CD25-T细胞，并对CD4+CD25-T细胞免疫功能进行初步鉴定，为Treg在诱导移植免疫耐受研究领域奠定基础。
　　 方法：本实验分为两部分进行：第一部分，从Lewis大鼠双侧股骨及胫骨中无菌取出骨髓细胞，采用Tris-NH4Cl裂解其红细胞，密度梯度离心法去除大部分的粒细胞、血小板以及其前体，粘附法逐步洗脱残余的粒细胞，获得骨髓单个核细胞(Mononuclear cell，MNC)。用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony stimulating factor，GM-CSF)和白介素-4(interleukin-4，IL-4)培养骨髓单个核细胞，分别收集培养第5、7、11、13天的细胞。用光镜及透射电镜观察细胞形态，流式细胞术(flow cytometer，FCM)检测细胞表型，MLR鉴定其功能。第二部分，IKK2dn转染imDC并负载供者BN大鼠抗原，将其与受者Lewis大鼠T细胞进行体外MLR诱导产生Treg，用免疫磁珠(magnetic active cell sorting，MACS)双阴性筛选法筛选出CD4+CD25-T细胞，用光镜及透射电镜观察细胞形态，FCM检测细胞纯度，实验分为两组：①对照组：丝裂霉素C灭活的BN大鼠脾细胞刺激Lewis大鼠T细胞进行MLR；②实验组：丝裂霉素C灭活的BN大鼠脾细胞刺激Lewis大鼠T细胞进行MLR，同时加入CD4+CD25-T细胞。用MTT法检测CD4+CD25-T细胞对MLR中Lewis大鼠T细胞的免疫作用。
　　 结果：1.每只大鼠双侧股骨及胫骨可获得(3.5±0.75)×107个单个核细胞，细胞活力检测>95％。培养的imDC和mDC通过光镜及透射电镜观察均符合其结构特征，流式细胞仪检测细胞表型：培养第7天的DC其CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达阳性率分别约为(39.35±1.58)％、(31.22±1.28)％和(33.34±5.55)％。培养第11天的DC其CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达阳性率分别约为(72.12±5.15)％、(59.44±3.02)％和(61.35±1.56)％，第11天的表型检测结果明显高于第7天(P<0.05)。第7天与第11天DC的MLR吸光度值比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.将转染IKK2dn并负载供者BN大鼠抗原的受者Lewis大鼠imDC与受者Lewis大鼠T淋巴细胞进行MLR诱导产生的Treg，经MACS筛选可以获得活性及纯度均在95％以上的CD4+CD25-T细胞，MTT法检测MLR中受者T细胞的增殖反应的吸光光度值：①对照组为0.259±0.057。②实验组：0.064±0.016。两组比较差异有统计学意义(.P<0.05)。
　　 结论：1.我们建立了一种稳定的大鼠骨髓源性DC的体外培养方法，用GM-CSF和IL-4培养大鼠骨髓源性单个核细胞5～7天，可以获得足够数量和纯度的imDC，适宜移植免疫耐受领域的研究。2.转染IKK2dn并负载抗原的imDC诱导产生的Treg，经MACS筛选可以获得高活性高纯度的CD4+CD25-T细胞。3.CD4+CD25-T细胞在MLR中对反应性T细胞具有免疫抑制作用。4.CD4+CD25-T细胞的分离及功能鉴定为体内、外实验研究移植免疫耐受提供实验基础和理论依据，并可能为进一步地建立临床移植免疫耐受奠定了基础。