人共信号分子B7-H3在炎症反应及肺癌肿瘤免疫逃逸中的作用机制研究

摘要

作为新近发现的共信号分子,B7-H3在T细胞免疫应答中的作用还存在较大争议,这也提示该分子功能具有多样性。与功能相比,B7-H3表达谱比较明确。该膜分子可在肿瘤组织以及诱导活化的单核巨噬细胞表达,且与临床进展密切相关。如前所述,共信号分子通常存在膜性以及可溶性两种形式,那么是否也存在可溶性B7-H3,有何临床意义？除可以调控T细胞免疫应答外,最近发现B7-H3也可调控其他组织细胞的生物学行为,那么B7-H3是否可以参与调控单核-巨噬细胞生物学功能,其机制如何？B7-H3在多种肿瘤组织呈异常高表达且与临床进展密切相关,那么肿瘤微环境中髓系来源细胞是否也表达该分子,表达的临床意义及作用机制如何？针对上述问题,本论文开展如下研究:
　　 第一部分:可溶性B7-H3的生物学特性及其检测的临床意义
　　 目的:研制sB7-H3定量检测试剂盒,鉴定人体内是否存在sB7-H3,并分析其生物学特征及其检测的临床意义。
　　 方法:利用自主研发的抗人B7-H3单抗4H7和21D4双夹心法配制sB7-H3ELISA检测试剂盒。在此基础上,检测不同年龄阶段健康人血清（血浆）中sB7-H3含量。检测外周血免疫细胞如树突细胞、淋巴细胞、单核细胞以及长期细胞株等膜型以及培养上清中可溶性B7-H3表达水平,并利用金属蛋白酶抑制剂进行干预,分析sB7-H3产生的可能机制。利用Western-blotting实验分析浓缩细胞培养上清中sB7-H3分子量,并利用流式细胞技术,分析该浓缩天然sB7-H3是否可与体外活化的T淋巴细胞结合,分析该天然形式sB7-H3是否为功能片段。筛查不同疾病状态下sB7-H3表达水平,分析该可溶性分子表达的临床意义。
　　 结果:利用抗B7-H3单抗4H7为包被抗体,生物素标记单抗21D4为检测抗体,成功构建sB7-H3ELISA试剂盒。该试剂盒检测区间为27-20,000pg/ml,线性检测区间为20-1,600pg/ml。准确性,灵敏度都达到同类产品国际水平。利用该试剂盒,我们发现人体内存在天然形式的sB7-H3,且不同年龄阶段水平不尽相同,以脐带血水平最高,成年后则无明显变化。检测健康人外周血单个核细胞以及体外培养的树突细胞,我们发现健康人外周血免疫细胞几乎都检测不到膜型B7-H3表达,但是在体外诱导活化的T淋巴细胞、单核细胞以及树突细胞则能同时检测到膜型B7-H3以及sB7-H3表达。因此,我们推测膜B7-H3可能是sB7-H3来源。金属蛋白酶抑制试验中也证实MMPs参与了sB7-H3表达调控。Western-blotting证实该可溶性分子大小约为16.5kDa。竞争抑制试验表明该天然形式可溶性分子且可与活化T细胞结合,证明其为具有生物学活性的功能片段。临床检测发现,sB7-H3在细菌引起的炎症性疾病患者体内水平显著升高,而在病毒性感染患者sB7-H3则未见明显变化。
　　 结论:成功构建可以定量分析sB7-H3的ELISA试剂盒,证实人体内存在天然形式sB7-H3,其来源为金属蛋白酶剪切而来的膜型B7-H3,在细菌性感染患者体内明显升高,具有临床检测意义。
　　 第二部分:B7-H3协同TLR2/TLR4信号通路促进脓毒症炎症反应的机制
　　 目的:研究共信号分子B7-H3对单核巨噬细胞的调控作用,分析该分子在炎症应答中的作用机制。
　　 方法:临床标本分析脓毒症患者外周血淋巴细胞及单核细胞上B7-H3R表达,并分析B7-H3R表达的调控机制。在此基础上,利用小鼠B7-H3Ig融合蛋白以及抗小鼠B7-H3阻断型单抗,研究炎症反应条件下B7-H3对骨髓来源巨噬细胞的调控作用。构建TLR-2以及TLR4基因过表达工程细胞株293,分析B7-H3发挥生物学作用是否依赖于TLR2/4信号。此外,构建内毒素动物模型,利用抗B7-H3抗体进行体内干预,分析B7-H3体内炎症应答中的生物学作用及对疾病进展的影响。
　　 结果:临床标本检测发现sB7-H3可以与单核巨噬细胞上潜在受体结合;进一步研究发现该分子以协同作用方式,增强LPS及BLP诱导的炎症反应,促进单核巨噬细胞分泌炎性细胞因子IL-6以及TNF-α。作用机制研究表明B7-H3协同作用依赖于TLR-2/4信号通路并可显著促进NF-κb活性。体内实验也证实阻断B7-H3抑制炎症应答,并可显著延长脓毒症小鼠生存时间。
　　 结论:本研究首次提出在脓毒症患者体内B7-H3的效应细胞为单核巨噬细胞,其在炎症应答中的生物学作用主要表现为依赖TLR信号调控固有免疫应答促进炎性细胞因子分泌。
　　 第三部分:组织浸润B7-H3+MDSC的生物学特性及其在肺癌免疫逃逸中的作用
　　 目的:分析肿瘤浸润部位B7H3+HLA-DR-CD14+MDSC表达特征、临床意义以及生物学功能。
　　 方法:收集手术切除的非小细胞肺癌癌灶部位、癌远端组织标本以及对应外周血标本60例,组织标本经过胶原酶消化处理、Ficoll分离获得单个核细胞;外周血标本直接溶血,检测组织以及血标本中HLA-DR-CD14+MDSC表达;分析B7协同刺激分子在该类细胞上的表达特征,结合病例资料分析其临床意义,通过体内外实验比较分析B7-H3-以及B7-H3+MDSC在表型、临床意义以及生物学功能等方面的差异。
　　 结果:(1)与健康对照相比,非小细胞肺癌患者外周血HLA-DR-CD14+MDSC比例显著升高(P＜0.01),B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3以及B7-H4都没有显著差异(P＞0.05);(2)HLA-DR-CD14+MDSC比例在肿瘤浸润部位较癌远端组织显著升高(P=0.02),B7-H3在癌灶部位HLA-DRCD14+MDSC上较癌远端组织表达显著升高(P＜0.01),其他B7家族协同刺激分子均无统计学差异(P＞0.05);(3)更为有意义的发现是,以B7-H3单抗圈门可以将HLA-DRˉCD14+MDSC分为两个亚群:B7H3+以及B7H3-HLA-DRˉCD14+MDSC;(4)结合病史,比较分析两类MDSC的临床意义,结果发现仅B7-H3+MDSC与肿瘤分期以及淋巴结转移密切相关(P＜0.05);(5)以流式细胞分选技术从浸润肺癌组织分离获得高纯度B7H3+以及B7-H3ˉMDSC两亚群细胞,并比较其对CD3+T功能的影响,结果发现两亚群细胞均能有效抑制T细胞体外增殖(P＜0.01),但两亚群之间并不存在显著差异(P＞0.05);(7)体内实验证实,未剔除B7-H3+MDSC组荷瘤小鼠较剔除组肿瘤生长更快(P＜0.05);分析两亚群对Treg体外扩增的影响,结果发现B7-H3+较B7-H3ˉMDSC更为有效扩增Treg(P＜0.05)。(8)荷瘤小鼠实验进一步证实肿瘤微环境可以诱导B7-H3+MDSC,且发现B7-H3在介导MDSC诱生Treg中发挥了部分作用。
　　 结论:鉴定了一类以B7H3+表达为特征的新型MDSC亚群,并证实该新型MDSC亚群可通过诱生Treg在肺癌肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。

目录

声明

苏州大学学位论文使用授权声明

指导小组成员:

研究背景

第一部分:共信号分子B7-H3研究进展

第二部分:单核巨噬细胞以及髓系来源抑制性细胞在免疫应答中的生物作用

小结:

参考文献:

第一部分:可溶性B7-H3的生物学特性及其检测的临床意义

前言

1、材料与方法:

2、结果:

3、讨论

参考文献:

第二部分:B7-H3协同TLR2/TLR4信号通路促进脓毒症炎症反应的机制

前言

1、材料与方法:

2、结果:

3、讨论

参考文献:

第三部分:组织浸润B7-H3+MDSC的生物学特性及其在肺癌免疫逃逸中的作用

前言

一、材料与方法

二、结果:

讨论

参考文献:

全文总结与展望

小结

展望

博士学习期间发表论文及获奖情况

本课题的受资助情况

缩写词表

附件

致谢