暗纹东方鲀线粒体基因组全序列和CD8基因的克隆与表达特征分析

摘要

暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)是具有较高经济价值的鱼类，其产量居鲀形目鱼类之前列，并能进行人工养殖。
　　 鲀形目鱼类的分子系统学研究是国内外关注的热点，从种级至目各分类阶元的系统发育研究中，多数是部分或全部用到了线粒体基因组序列。为此，本研究通过设计13对引物进行PCR扩增并测序，首次获得了暗纹东方鲀线粒体基因组DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)全序列，并结合东方鲀属其它种类的mtDNA进行了线粒体全基因组水平的系统发育分析。
　　 暗纹东方鲀mtDNA基因组序列全长16444bp，A+T含量为55.8％，其mtDNA由22个tRNA基因、2个rRNA基因、13个蛋白质编码基因和1段819 bp非编码的控制区(D-loop)所组成。蛋白质基因除COI和ND6的起始密码子为GTG、CCT以外，均为典型的起始密码子ATG。ND1、ATPase8、COIII、ND4L、ND5、Cyt b使用典型的终止密码子TAA，其他的使用不完全终止密码子。除ND6和tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNAcys、tRNATyr、tRNAser、tRNAGlu、tRNAPro在L-链上编码之外，其余基因均在H-链编码。基因排列顺序与已测定的鲀类一致。tRNA基因核苷酸长度为64-73nt，预测了22个tRNA基因的二级结构，大多呈较为典型的三叶草状。基于线粒体基因组全序列构建的进化树表明，暗纹东方鲀和红鳍东方鲀(T.rubripes)、中华东方鲀(T.chinensis)聚成一个姊妹群。研究表明，暗纹东方鲀线粒体基因组的组成、顺序、编码链的选择、tRNA的结构以及GC和AT偏斜等，都与典型的脊椎动物线粒体相同，亦未发现重排和假基因。基于东方鲀属鱼类线粒体全序列构建的进化树与形态学分类的阶元关系比较吻合，结果再次支持东方鲀属鱼类为一个单系类群。研究将为暗纹东方鲀线粒体基因组的遗传特点和物种多样性的分析提供分子依据。
　　 在暗纹东方鲀的放养过程中，由于集约化养殖的现状会导致鱼体经常受到细菌、寄生虫以及病毒的侵染而导致免疫能力下降。鱼类分子免疫学尚处于起始阶段。在免疫应答研究中，相对于体液免疫相关分子，细胞免疫相关分子的研究更少。因此，本文选取了细胞毒T细胞(CTL)表面辅助受体CD8分子进行研究。CD8是T细胞表面的双链糖蛋白，存在CD8α和CD8β两种亚基形式，是与Ⅰ型主要组织相容性复合体( MHC I)结合，是T细胞表面受体(TCR)的共受体，也是T淋巴细胞表面的重要标志物，作为粘附分子和辅助受体广泛参与TCR对MHC I分子递呈抗原的识别和信号传递过程。本研究在前期工作基础上，克隆和分析暗纹东方鲀CD8分子两亚基CD8α和CD8β，运用荧光实时定量PCR(Real-time RT-PCR)、免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)、流式细胞术(flow cytometry, FCM)等方法探讨CD8在mRNA和蛋白质水平上的基因表达特征。
　　 克隆获得的暗纹东方鲀CD8α cDNA序列为1533 bp，包含一个657 bp的开放读码框(ORF)，编码218个氨基酸；其对应的基因组序列为1533 bp，包含5个内含子和6个外显子。CD8β cDNA序列长1063 bp，ORF长为654bp，编码217个氨基酸，其相应的基因组序列长2639 bp，包含6个外显子和6个内含子。生物信息学表明，未成熟的CD8α和CD8β分子多肽序列都由信号肽、胞外可变区、铰链区、跨膜区和胞内区五部分组成。在胞外区可变区和铰链区部分各有两个高度保守的半胱氨酸残基，参与链内和链间二硫键的形成。氨基酸序列多重比对表明，暗纹东方鲀与其他鱼类的CD8蛋白在结构上是相似的，进化上和鲈形目、鲽形目的鱼类关系较近。RT-PCR结果显示，CD8α和CD8β mRNA在暗纹东方鲀组织中的表达量基本上是相一致的，各组织中都有表达但存在差异性。CD8在胸腺中呈现最高的表达水平，在其他组织器官中也有一定量的表达，而在肝脏中的表达量低弱。IHC和FCM研究结果表明，CD8在暗纹东方鲀的组织器官均呈现免疫细胞阳性，但组织间存在一定差异。其中，属于主要免疫器官的头肾、胸腺、脾脏等CD8+细胞数量较多，而属于黏膜样淋巴组织的肠、皮肤、腮等相对于体肾、脑、心脏、肝脏等组织的CD8+细胞检出率较高。这与RT-PCR结果较为一致，提供了有力的形态学和分子水平的依据。这些结果为揭示CD8分子在暗纹东方鲀免疫系统中的作用奠定了基础。

目录

声明

苏州大学学位论文使用授权声明

第一章 文献综述

第二章 研究目的与内容

第三章 一般材料和常用方法

第四章 暗纹东方鲀线粒体基因组全序列测定与分析

4．1 引言

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

参考文献

第五章 暗纹东方纯CD8α和CD8β克隆与序列分析

5．1 引言

5．2 方法

5．3 结果

5．4 讨论

参考文献

第六章 暗纹东方纯CD8α和CD8β的表达特征分析

6．1 引言

6．2 方法

6．3 结果

6．4 讨论

参考文献

小结

攻读博士学位期间发表的文章

附录

附录1 原始数据

附录2 缩略词表

致谢