转染IKK2dn的受者树突状细胞诱导产生的CD4+CD25-T细胞延长肾移植大鼠生存时间的研究

摘要

目的:建立大鼠同种异体肾移植的急性排斥反应动物模型，观察转染重组腺病毒介导的IKK2dn（recombinantadenovirus-mediatedIKK2dn，Adv-IKK2dn）基因并负载供者抗原的受者树突状细胞（dendriticcells，DC）诱导产生的CD4+CD25-T细胞回输是否延长同种异体肾移植大鼠的生存时间，并探讨其机制。
　　 方法:应用5ng/ml大鼠源性粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)和5ng/ml大鼠源性白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)诱导Lewis大鼠（受者）骨髓源性细胞分化为未成熟DC(immaturedendriticcells，imDC)。收集第5d细胞，Adv-IKK2dn转染DC,48h后收集细胞与BN大鼠（供者）抗原肽共孵育,48h后收集悬浮的细胞为转染IKK2dn并负载供者抗原的受者DC。将转染IKK2dn并负载供者抗原的受者DC与受者T细胞混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction，MLR)，共培养72h后，采用免疫磁珠分离法(magneticactivatedcellsorting，MACS)分选CD4+CD25-T细胞，体外扩增培养。肾移植受者为Lewis大鼠，分为初始T细胞组、AdvO-CD4+T细胞组、CD4+CD25-T细胞组、排斥组，术前7d分别输注1×107个初始CD4+T细胞、Adv-0-DC诱导产生的CD4+CD25-T细胞、Adv-IKK2dn-DC诱导产生的CD4+CD25-T细胞和等量生理盐水，供者均为BN大鼠。另设第三方供者组，术前处理同CD4+CD25-T细胞组，供者为Wistar大鼠。移植术后观察各组大鼠生存时间;测定受者T淋巴细胞增殖能力;检测血清白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)以及转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)表达水平;监测血清肌酐水平;移植肾的病理学检查，判断排斥反应程度。
　　 结果:1、流式细胞仪检测第5dDC表型:CD80、CD86、MHC-Ⅱ的阳性表达率较低，分别为19.0±2.01％，17.3±1.17%、27.1±2.11%，DC处于未成熟状态。2、初次MLR结果显示，与负载供者抗原的未转染的DC以及转染空载体的DC(Adv-O-DC)相比，Adv-IKK2dn-DC刺激受者T细胞增殖能力低下，差异有统计学意义(P＜0.05)。3、Adv-IKK2dn-DC在体外可以刺激Lewis大鼠T细胞诱导产生CD4+CD25-T细胞，Adv-IKK2dn-DC诱导产生的CD4+T细胞中低表达CD25（17.8＜0.89%），与对照组（72.8±1.99%）及转染Adv-0组（63.3+1.70%）相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。收获的CD4+CD25-T细胞经流式细胞仪检测纯度达到94.2＜1.91%，经体外培养扩增后，细胞数量可达到2.0～2.5x106个/ml。4、CD4+CD25-T细胞组肾移植大鼠生存时间为(28.5±2.36)d，较其他各组显著延长(P＜0.01）;与其他各组相比，CD4+CD25-T细胞组表达高水平IL-10和TGF-p(P＜0.05或P＜0.01);与排斥组、AdvO-CD4+T细胞组、第三方供者组相比，CD4+CD25-T细胞组低表达IL-2和IFN-γ(P＜0.05);CD4+CD25-T细胞组T淋巴细胞的增殖能力明显低于其他4组(P＜0.05或P＜0.01);病理学检查CD4+CD25-T细胞组发生排斥反应的病理级别较低。
　　 结论:转染IKK2dn基因并负载供者抗原的受者DC诱导产生的CD4+CD25-T细胞回输可以延长同种异体肾移植大鼠生存时间，并具有针对供者的特异性，其机制可能与诱导的IL-10、TGF-β的高分泌有关。

目录

声明

引言

材料与方法

实验材料

实验方法

结果

一、大鼠骨髓源性DC鉴定

二、初次MLR

三、CD4+CD25T细胞的获取及扩增

四、建立稳定的大鼠同种异体肾移植模型

五、肾移植术后检测项目

六、病理学检查

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间公开发表的论文

中英文对照缩略词表

致谢