咖啡因苦味适应小鼠模型的建立及其外周机制初步研究

摘要

味觉偏好具有很大程度的可塑性，早期的味觉经历可以修饰某些基因的表达，从而改变后期的味觉感知。目前对于味觉偏好可塑性的研究多集中于甜味，对于苦味偏好可塑性的研究则较少。而近年来越来越多的人喜好饮用咖啡、茶及苦味蔬菜等，这种现象背后隐藏的味觉感知机制值得我们去探索。故本实验采用食物中常用的一种苦味物质-咖啡因，以ICR小鼠为实验动物来摸索构建咖啡因苦味适应小鼠模型并对其味觉感知的外周机制进行初步研究。本论文采用行为学、荧光免疫组织化学、蛋白免疫印迹等多种方法与系列实验，分析了不同性别、不同阶段ICR小鼠经过不同浓度咖啡因暴露后的行为学改变，从而构建了咖啡因苦味适应小鼠模型并分析了外周味觉系统的变化情况，包括舌面菌状味蕾形态及α-gustducin表达模式的改变等。实验结果从细胞生物学方面理解了咖啡因苦味适应行为与外周味觉系统的可塑性变化之间的关系，为味觉可塑性研究提供了新的思路与方法。
　　 应用双瓶喜好行为学测试方法，我们发现咖啡因暴露对小鼠后期行为学的影响同ICR小鼠的性别、年龄及暴露时采用的咖啡因浓度相关。实验结果表明:对出生后21天的雄性ICR小鼠进行200、500、750 mg/l咖啡因暴露3周后，均会改变成年小鼠对咖啡因的感知模式，同对照组相比，偏好模式由“冷漠-厌恶”转变为“冷漠-偏好-冷漠-厌恶”，且厌恶阈值提高，但500、750 mg/l的咖啡因显著减轻了小鼠的体重，可能对其某些生理功能造成影响;用200 mg/l咖啡因对出生后32天、49天的雄性ICR小鼠进行暴露，结果其对咖啡因的感知模式同对照组一致;出生后21天的雌性小鼠用200 mg/l咖啡因暴露3周后，小鼠对咖啡因溶液的感知模式也发生改变且厌恶阈值提高，同用200 mg/l咖啡因暴露出生后21天的雄性小鼠相比，雌性小鼠对低浓度咖啡因的敏感度更高，对高浓度咖啡因的耐受力更强。本研究成功构建了咖啡因苦味适应小鼠模型，为以小鼠为动物模型研究咖啡因苦味偏好机制提供了行为学基础。
　　 应用整体包埋和荧光免疫组化技术，对经过200 mg/l咖啡因暴露的P21雄性小鼠的舌面菌状味蕾性状进行研究，结果表明:咖啡因暴露组小鼠的菌状味蕾其横截面积显著减小，但单个味蕾内含有的味细胞数目没有变化，说明味蕾横截面积的变化可能是由于味细胞体积变小导致;同时咖啡因暴露组小鼠味蕾内α-gustducin阳性细胞数目显著小于对照组。
　　 通过蛋白免疫印迹，我们研究了信号转导过程中关键蛋白的表达情况，实验结果表明:P21雄性咖啡因暴露组小鼠舌上皮内α-gustducin的表达量显著低于对照组，而TRPM5的表达量却没有发生改变;P21雌性ICR小鼠的结果与雄性小鼠一致。以上结果表明小鼠早期暴露一定浓度的咖啡因溶液对外周味觉感受器及味觉信号转导蛋白的表达有影响，这些结构与功能的显著变化，可能是小鼠咖啡因苦味适应的细胞学基础。
　　 总之，我们的实验成功构建了咖啡因苦味适应小鼠模型，并初步研究了其外周味觉感受机制。但味觉感知是一个相当复杂的过程，大脑是如何处理接收到味觉信息从而形成特定的味觉，中枢神经系统又是如何形成味觉偏好的可塑性、苦味适应是否维持终身等问题需要进一步的研究。

目录

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序言

一、关于味觉的综述

1、味蕾基本结构

2、味蕾的分布

3、味蕾细胞的分类

4、味觉感知

二、味觉偏好的形成及其机制研究

1．导致味觉偏好个体差异性的因素

2．苦味偏好的研究

三、咖啡因与味觉感知

1．咖啡因的生理作用

2．咖啡因与苦味感知

3．咖啡因的味觉信号转导

四、选题背景、研究目标及研究意义

1．选题背景

2．研究目标及研究意义

第一章 口腔暴露咖啡因对成年小鼠苦味偏好影响的行为学研究

1．实验材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂及溶液配制

1．3 主要仪器与设备

2．实验设计与方法

2．1 实验设计路线

2．2 实验方法

2．3 数据分析方法

3．结果

3．1 P21雄性小鼠口腔暴露不同浓度咖啡因溶液的行为学分析

3．2 不同年龄段雄性小鼠暴露200mg/l咖啡因溶液的行为学分析

3．3 不同浓度咖啡因溶液暴露P21雌性小鼠的行为学分析

4．讨论分析

第二章 口腔暴露咖啡因对小鼠菌状味蕾的影响

1．材料方法

1．1 实验动物

1．2 主要试剂及溶液配制

1．3 主要仪器及设备

2．实验设计与方法

2．1 实验设计路线

2．2 组织取样、固定、染色

2．3 数据分析

3．结果分析

3．1 小鼠舌面菌状乳头数量的比较分析

3．2 咖啡因暴露对味细胞数、味蕾横截面积及Gα-gustducin表达的影响

3．3 结果分析

4．讨论分析

第三章 口腔暴露咖啡因对味觉信号转导蛋白表达的影响

1．实验材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂及溶液配制

1．3 主要仪器与设备

2．实验设计与方法

2．1 蛋白取材

2．2 蛋白免疫印迹(western blot)

2．3 数据分析方法

3．结果

4．讨论分析

本文结论

参考文献

攻读学位期间公开发表的论文

致谢