家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的表达调控研究

摘要

昆虫主要依靠体内蜕皮激素滴度的变化，调节幼虫蜕皮、蛹变态和成虫分化等胚后发育。昆虫蜕皮激素受体(ecdysonereceptor，EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle，USP)是核内受体，是蜕皮激素的分子靶标。因此研究蜕皮激素与EcR和USP的作用方式和调控机理具有重要理论意义和应用价值。
　　 用2×10-3μg/μL蜕皮激素溶液浸泡过的桑叶饲喂家蚕5龄幼虫，采用双跟踪标定定量PCR（dual-spike-inqPCR）方法，检测BmEcR-A、BmEcR-B1和超气门蛋白(ultraspiracle，USP)基因BmUSP在家蚕马氏管、脂肪体、中肠组织的转录水平变化，通过比较组织间的转录水平，分析EcR和USP基因在蜕皮激素代谢过程中的作用与表达调控特征。
　　 结果：表明：家蚕EcR的2种同工型基因BmEcR-A和BmEcR-B1的mRNA转录水平均变化显著，在脂肪体中的转录水平最高，其它组织相对较低；BmUSP的mRNA转录水平同样变化显著，且在脂肪体中的转录水平最高，马氏管次之，中肠最低。
　　 另检测正常状态下4龄眠期和5龄末期BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP的mRNA转录水平相对其它时期较高，且脂肪体中的转录水平要明显高于其它组织。BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP均在家蚕幼虫脂肪体中高量表达，表明脂肪体是蜕皮激素重要的靶组织。
　　 我们发现，BmEcR-A在家蚕幼虫中的表达水平高于BmEcR-B1，而BmUSP的表达水平要明显高于BmEcR-A和BmEcR-B1，BmEcR-A和BmUSP从表达时间要早于BmEcR-B1，这说明BmEcR-A先于BmEcR-B1发挥生理功能，同时本研究结果表明，在家蚕中EcR-A发挥着比EcR-B1更为重要的作用。
　　 重组AcNPV作为用于昆虫培养细胞的真核表达载体，可感染部分家蚕品种，且感染症状较BmNPV轻，可以存活较长时间，且不会经口传染，因此将它用作一种瞬时表达载体来研究基因的功能及其表达调控具有一定的优越性。为了研究蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)基因的表达调控机制，我们利用rAcMNPV作为基因介导载体的双荧光定量表达载体系统对其启动子区域的功能进行分析。
　　 首先，构建一个FHNLuc-A3RL双荧光供体质粒，其中萤火虫荧光素酶(FLuc)基因由EcR和USP基因的启动子带动，另一个由家蚕A3启动子控制的海肾荧光素酶(RLuc)作内参。将BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因启动子进行5’端分段顺次缺失，将各启动子片段分别装入双荧光质粒FHNLuc-A3RL中，成功获得重组的转移载体，通过Bac-to-Bac系统制备重组杆状病毒，并制备空白对照病毒。将这些重组病毒分别注射感染五龄起家蚕，三天后剖取各组织，分别测定报告基因FLuc和RLuc的酶活。
　　 结果：表明，在2×10-3μg/μL蜕皮激素诱导下，家蚕各组织BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表达均比正常组织上调2-3倍左右；正常状态下和外源蜕皮激素诱导下，各基因启动子活性都是在脂肪体中最高，再次表明脂肪体是蜕皮激素重要的靶组织。
　　 BmEcR-A基因启动子-637～-274区域内存在该启动子活性相关的重要元件，是该基因启动子的主要活性区域；BmEcR-B1基因启动子的关键区域位于-435～+1，且-807～-435区域存在能增强启动子活性的元件；BmUSP基因启动子-1134～-615和-615～-281区域内存在启动子活性相关的重要元件，是该基因启动子的主要活性区域。
　　 在脂肪体中，BmEcR-A基因启动子-637～-274区域内存在与20E诱导相关的作用元件；BmEcR-B1基因启动子-435～+1区域内存在与20E诱导相关的作用元件；BmUSP基因启动子-1134～-615和-615～-281区域内存在与20E诱导相关的作用元件。马氏管及其它组织BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因启动子的活性与脂肪体中类似。
　　 总之，我们的结果表明脂肪体是蜕皮激素重要的靶组织，在家蚕中EcR-A发挥着比EcR-B1更为重要的作用；BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因启动子区域中存在与蜕皮激素诱导相关的重要元件。本研究为了解ECR和USP基因的表达调控机制，并进一步研究蜕皮激素和EcR/USP之间的相互作用机理奠定基础。