家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的启动子分析

摘要

20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)在昆虫的蜕皮和变态期间扮演着重要的角色,包括形态发生,细胞凋亡,繁殖和行为反应等过程。蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle, USP)是核受体超家族的成员,是20E的分子靶标。因此研究家蚕EcR和USP基因在蜕皮激素诱导下的表达调控具有一定的理论意义。本研究主要内容包括：
　　⑴构建FHNLuc-A3RL双荧光质粒,其中萤火虫荧光素酶(FLuc)基因由 BmEcR和BmUSP基因不同长度的启动子片段启动,另一个由家蚕actin3启动子启动的海肾荧光素酶(RLuc)作内参基因。通过Bac-to-Bac系统制备重组杆状病毒,将这些重组病毒分别注射五龄家蚕,测定组织中各启动子片段的荧光素酶活性。结果表明:无论在正常条件还是20E诱导下,BmEcR-A,BmEcR-B1和BmUSP基因各启动子片段在脂肪体中的活性较高,而在中肠和马氏管中的活性较低。在BmEcR-A启动子中,-637~-518 bp和-278~-177 bp之间为重要的调控区域;而在BmEcR-B1启动子中-325~-198 bp之间为重要调控区域;在BmUSP启动子中,-485~-374 bp之间为重要的正调控启动子区,而在-374~-281 bp之间为负调控因子结合的序列。
　　⑵对BmEcR-A的重要启动子区进行功能分析,构建不同长度顺次缺失以及重要区域突变的pGL3-Basic重组质粒,与内参载体pRL-TK共转染BmN细胞。结果表明:在BmN细胞内它们的启动子活性都能被蜕皮激素诱导。EcR-A启动子转录起始位点上游-637~-612 bp之间为核心启动子区,但是删除-197~-177 bp序列后其启动子活性明显增加了,说明在该区域存在有抑制因子结合位点。生物信息学分析表明-637~-612 bp之间存在HSF转录因子的结合位点,而在-197~-177 bp之间则没有预测到转录因子结合位点。
　　⑶分析-197~-177 bp之间与之结合的转录因子,利用链亲和素琼脂糖树脂技术,通过设计生物素标记的探针,与家蚕脂肪体核蛋白抽提物孵育,洗脱,纯化后进行蛋白质SDS-PAGE电泳分析并利用质谱技术鉴定,结果显示,在-197~-177 bp之间可能结合有家蚕转酮醇酶蛋白。
　　⑷对BmEcR-B1和BmUSP的重要启动子区进行功能分析,构建不同长度顺次缺失的pGL3-Basic重组质粒,与内参载体pRL-TK共转染BmN细胞。结果表明:在EcR-B1启动子中-325~-295 bp之间包含重要的调控因子对于EcR-B1基因启动子的转录调控是必要的。序列分析这一区域显示包含有Dfd和HSF转录因子的结合位点;在BmUSP启动子中,-485~-445 bp之间含有正调控因子结合位点,而在-307~-281 bp之间认为可能含有抑制因子结合位点,分别对其生物信息学分析显示含有AP-1和Dfd转录因子的结合位点。
　　⑸通过检测家蚕BmEcR和BmUSP基因启动子在家蚕组织中的萤光素酶活性并找到一些重要的调控区域。并且进一步在BmN细胞水平上对这些重要的调控区域进行分析得到了BmEcR和BmUSP基因的核心启动子区以及相关的蛋白因子。这项研究为进一步鉴定EcR和USP的顺式作用元件和反式作用因子以及阐明EcR和USP组织特异性表达提供了重要的基础。

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引言

第一章 文献综述

1 昆虫蜕皮激素受体研究概况

2 蜕皮激素受体

3 基因表达调控

4 启动子研究方法

第二章 材料与方法

1 家蚕品种及饲养

2 菌株、病毒、质粒和细胞系

3 常用试剂和缓冲液配制

4 实验方法

第三章 BmEcR-A基因启动子活性研究

第一节 家蚕组织中BmEcR-A基因启动子活性分析

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 BmEcR-A基因核心启动子分析

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 家蚕蜕皮激素受体亚型BmEcR-B1基因启动子活性研究

第一节 家蚕组织中BmEcR-B1基因启动子活性分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 家蚕BmEcR-B1基因核心启动子分析

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 家蚕超气门蛋白基因启动子活性研究

第一节 家蚕组织中BmUSP基因启动子活性分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 家蚕BmUSP基因核心启动子活性分析

1材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

第六章 家蚕BmEcR-A基因启动子重要调控区域的蛋白结合分析

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

结论

1 研究结果

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢