氡/α粒子照射致肺支气管细胞线粒体损伤及RNA表达改变

摘要

目的：
　　氡（Rn）是除吸烟外致人类肺癌的第二大危险因素。氡及其子体对健康的主要危害在于其发射的高能量α粒子，吸入体内后可对支气管和肺细胞形成高 LET照射。线粒体DNA（mtDNA）是致癌物作用的重要靶点。本课题在动物和细胞水平上，研究氡染毒和α粒子照射对肺组织和支气管上皮细胞的损伤效应，在建立人支气管上皮细胞线粒体DNA敲除模型（ρ-BEAS-2B）的基础上，观察照射后细胞转化过程中线粒体结构和功能的改变，同时采用高通量芯片技术，筛选ρ+与ρ-细胞间以及α粒子照射前后差异表达的mRNA和微小RNA（miRNA），为探讨线粒体在氡致细胞恶性转化中的作用机制提供实验依据。
　　方法：
　　Wistar大鼠置于多功能生态氡室慢性吸入染毒，累积染毒剂量达100、200、400工作水平月（Working level month, WLM）。对细胞进行氡染毒和α粒子照射，氡暴露浓度为20000Bq/m3，染毒时间20min/次，染毒3d后重复1次，连续染毒2次后作为染毒第1代（Rn1），分别染氡10代（Rn10）和30代（Rn30）。α粒子照射剂量为0.1、0.25、0.5和1.0Gy，分二次和四次照射。采用EB法建立人永生化支气管上皮细胞（BEAS-2B）线粒体DNA部分和完全敲除模型（ρ-,ρ0）。Real-time PCR检测线粒体DNA拷贝数变化，流式细胞仪法检测线粒体膜电位、细胞内活性氧（ROS）水平和细胞周期的改变。通过血清抗性、细胞增殖活性、细胞锚着独立生长和Transwell膜侵袭试验观察细胞的转化情况。采用NimbleGen-135K mRNA表达谱芯片和miRCURYTM芯片筛选差异表达的mRNA和miRNA，并用实时荧光定量PCR进行验证。
　　结果：
　　大鼠氡染毒后，肺组织氧化损伤明显，8-OHdG和线粒体拷贝数随染毒剂量的增加而增加，T-AOC含量则随染毒剂量的增加而降低。与细胞周期相关的基因P53， RB1，MDM2，MDM4，CDK2和CDK4等的表达均降低。成功建立了BEAS-2B细胞线粒体DNA敲除（ρ-）及α粒子照射的细胞模型。经照射传代，细胞获得锚着独立生长和侵袭能力，逐渐出现恶性转化的趋势。α粒子照射后细胞线粒体膜电位升高，ROS含量增多，线粒体拷贝数增加。细胞周期进程中G1、G2期细胞减少，S期细胞增多，细胞的分裂增殖加快。细胞受到α粒子照射后，在细胞周期相关的基因中，CDK2和CDK4表达上调，提示G1向S期的进程被加速，同时P53、RB1、MDM2和MDM4的表达也都上调，其对细胞周期的调控作用被激活。该结果与体外氡染毒细胞的结果相同，从而证实氡对细胞的毒作用是通过氡及子体的衰变产物发射的α粒子所引起。mRNA表达谱的分析结果显示，α粒子照射后，ρ+-P40细胞中表达上调的基因主要与细胞粘附，细胞凋亡和细胞分化等功能相关；表达下调基因与蛋白质翻译，负调控转录因子活性，免疫应答和 G蛋白信号通路等功能有关。上调的基因主要涉及与 MAPK、粘附分子、氨基酸代谢、胰岛素代谢和WNT等信号通路的激活，以及TGF-β、嘌呤代谢、膀胱癌和小细胞肺癌等信号通路的抑制。ρ--P40中，上调的基因与细胞凋亡，氧化应激，蛋白磷酸化，细胞粘附及蛋白质的合成等功能相关；下调的基因与细胞粘附，细胞间信号传递，细胞分化与乏氧反应等功能相关。上调的基因主要涉及细胞因子受体相互作用， MAPK、粘附分子、氨基酸代谢降解、系统红斑狼疮，细胞周期，P53信号通路以及小细胞肺癌等通路的激活，以及 TGF-β、轴突导向，泛素介导蛋白，神经活性配体受体相互作用以及WNT等信号通路的抑制。将ρ+细胞和ρ-细胞经α粒子照射后的通路改变相比较，发现与小细胞肺癌相关的通路发生了相反的变化。在ρ+细胞中，该通路受到抑制，而在ρ-细胞中，该通路则被激活。在差异表达的miRNA中，筛选出一批与线粒体相关的 miRNA，其中具有细胞周期调节功能的 let-7在ρ+-P40细胞中表达升高而在ρ--P40细胞中表达降低。对差异表达的miRNA进行了靶基因预测并构建了相关靶基因的相互作用网络，其中miR-107在ρ+-P40和ρ--P40细胞中有着共同的靶基因COL12A1。miR-494靶基因FBN1和CUL1在ρ+-P40细胞表达上调，参与细胞骨架构成及在细胞周期中起负向调控。let-7c在ρ+-P40细胞中表达上调而在ρ--P40细胞中表达下调，其靶基因 COL1A1，CDKN1A，CDK6和CLDN1在ρ--P40细胞中表达上调但在ρ+-P40细胞中表达却未见明显变化，提示mtDNA敲除激活了这些靶基因的功能。
　　结论：
　　1、建立氡吸入染毒的动物模型和α粒子体外照射的细胞模型，采用EB诱导法构建了mtDNA部分敲除的人支气管上皮细胞株（ρ-）。观察氡/α粒子致mtDNA拷贝数，线粒体膜电位和细胞内ROS水平等相关的毒性效应，以及细胞受照后发生恶性转化的情况。
　　2、α粒子照射后，细胞周期相关的调控基因被激活而表达上调，促进细胞从G1期进入S期，从而加速了细胞周期的进程。该结果与体外氡染毒细胞的结果相同，从而证实氡对细胞的毒作用，也是通过氡及子体的衰变产物发射的α粒子所引起。
　　3、通过高通量芯片筛选，发现了一批ρ+与ρ-细胞间以及α粒子照射前后差异表达的mRNA和miRNA。证实了部分细胞周期相关基因如CDK2和CDK4，以及部分miRNA如miR-494和let-7c在ρ+和ρ-细胞中的表达不同，提示线粒体在细胞受照射后周期进程加速和细胞恶性转化的过程中，起着至关重要的作用。

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引言

第一部分 氡染毒致肺组织细胞线粒体及细胞周期通路改变

第一节 氡染毒大鼠模型的建立

第二节 氡染毒致大鼠肺组织线粒体及细胞周期通路改变

第三节 氡染毒致人支气管上皮细胞线粒体及细胞周期通路改变

第二部分 α粒子照射致人支气管上皮细胞线粒体及细胞周期通路改变

第一节 人支气管上皮细胞mtDNA敲除模型的建立

第二节 α粒子照射致BEAS-2B细胞线粒体改变

第三节 α粒子照射致细胞周期通路改变

第三部分 α粒子照射致人支气管上皮细胞

第一节 α粒子照射致线粒体相关mRNA表达改变

第二节 α粒子照射致线粒体相关miRNA表达改变

第三节 差异miRNA靶基因分析

结论

参考文献

综述

参考文献

研究生期间参与的科研项目和发表的文章

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致谢