PD-1负性和OX40正性共刺激信号在类风湿性关节炎免疫病理中的作用机制及临床意义

摘要

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是累及关节的炎症性疾病，临床表现为对称性的关节疼痛和肿胀，伴发软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形造成残疾，部分RA患者还同时合并肺部、眼部、心血管系统和神经系统等关节外表现，是造成人类丧失劳动力和致残的重要原因之一。RA的病理特点包括关节滑膜的增生，新生血管的形成以及炎性细胞的浸润。
　　RA的发病机制比较复杂，涉及遗传、环境和免疫因素。其免疫病理机制主要表现为T细胞介导的自身免疫性疾病，在RA的自身免疫进程中，炎性T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等浸润关节滑膜，细胞之间的相互作用导致自身抗体的生成和促炎症细胞因子的分泌。集落刺激因子、趋化因子和粘附分子的表达招募巨噬细胞样的滑膜细胞和破骨细胞，关节结构遭到破坏。其中CD4+辅助性T细胞(helper T cell,Th)在RA免疫病理中的作用至关重要，包括Th1、Th2、Th17细胞等。近年来的研究还发现，在RA中存在异常升高的CD4+CD28-T细胞亚群，以非CD28依赖的方式持续活化，具有长期存活、克隆扩增的特性，被视作是自身反应性的效应性记忆性T细胞。
　　T细胞的活化需要双信号，抗原肽-MHC分子复合物与T细胞表面受体(TCR)结合提供第一信号，第二信号则来源于抗原提呈细胞(APCs)和 T细胞表面共刺激分子间的相互作用。共刺激分子包括B7/CD28和肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家族，在调控T细胞的活化中发挥重要的作用。
　　PD-1属于B7/CD28家族共刺激分子，PD-L1是其配体之一，与PD-1结合后抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌。人PD-1Δex3 mRNA剪接异构体可能编码可溶性PD-1(sPD-1)，具有阻断PD-1/PD-L1负性信号和促进T细胞增殖的功能。OX40与其配体OX40L属于TNF/TNFR家族共刺激分子，OX40/OX40L信号在促进记忆性T细胞的生成、分化和活化中起着重要的作用。
　　PD-1和OX40信号的异常导致T细胞生物学行为的改变。在动物模型的研究中，PD-1信号缺失或被阻断可以导致一系列自身免疫性疾病；而OX40信号敲除或被阻断则对自身免疫性疾病有治疗作用。在类风湿性关节炎患者的关节滑膜液(synovial fluid,SF)中富含CD4+PD-1+和CD4+OX40+T淋巴细胞，提示PD-1和OX40信号异常参与了RA的免疫病理过程。
　　但是在RA患者中，PD-1的表达和CD28的缺失并不能清除自身反应性T细胞，以维持共刺激信号在自身免疫中的平衡。由此推断，在RA免疫病理中可能存在负性PD-1和正性OX40共刺激信号的失衡，促进CD4+自身反应性T细胞的异常活化，从而诱发自身免疫而导致病情迁延不愈。
　　鉴此，本研究从RA患者临床样本和胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠模型两方面入手，分析PD-1和OX40在外周和炎性部位的表达，揭示两者之间的相互关系。同时检测RA患者和CIA小鼠中CD4+CD28-T细胞表面PD-1和OX40的表达，通过分析CD4+CD28-PD-1lowOX40+T细胞亚群的异常变化，探讨PD-1和OX40信号的失衡在关节炎进展中的临床病理意义。通过体外刺激，PD-1融合蛋白干预实验，揭示可溶性PD-1(sPD-1)在RA中的免疫病理作用。由此为RA诊断和预后判断提供有临床应用意义的生物学标志，同时也为提出新的免疫干预靶点提供理论和实验依据。
　　第一部分PD-1和OX40在类风湿性和胶原诱导性关节炎CD4+T细胞上的表达
　　【目的】检测RA患者和胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠中PD-1和OX40的表达，分析两者之间的关系，探讨其在RA患者和CIA小鼠中的临床意义。
　　【方法】选取71例RA患者作为研究对象，44例骨性关节炎(osteoarthritis,OA)患者作为疾病对照，47名健康志愿者作为健康对照(healthy controls,HC)。研究样本的外周血(PB)标本使用红细胞裂解液处理，关节滑膜液(SF)使用透明质酸酶消化和密度梯度离心法处理，获得单个核细胞。使用Ⅱ型胶原(CⅡ)诱导CIA小鼠模型，密度梯度离心法分离小鼠脾脏单个核细胞，通过流式细胞技术检测RA患者和小鼠中CD4+T细胞表面PD-1和OX40的表达。同时通过免疫组织化学技术检测RA患者关节滑膜组织中PD-1和PD-L1的表达。
　　【结果】
　　(1)在RA患者外周血单个核细胞(PBMCs)中，CD4+T细胞比例与对照比较显著下降(p=0.045)；CD28的表达较OA患者和HC降低(p=0.019)；比较CIA和正常对照(NC)小鼠脾脏细胞中免疫分子的表达，结果发现与RA患者中的表现一致。
　　(2)免疫荧光标记、流式检测发现，在RA患者外周血和关节滑膜液中PD-1和OX40在CD4+T细胞上的表达显著升高(p<0.05)；同时在CD4+PD-1+T细胞中OX40的表达也明显升高(p<0.01)。
　　(3)免疫组织化学检测结果显示，RA患者滑膜组织中PD-1(p=0.026)和PD-L1(p=0.048)的表达较对照明显升高。
　　(4)在CIA小鼠脾脏中，CD4+T细胞上PD-1(p<0.001)和OX40(p<0.001)的表达异常升高。
　　(5)临床病理特点分析显示，CD4+T细胞上PD-1和OX40的表达与RA患者的疾病活动度、自身抗体的生成以及与CIA小鼠关节炎轻重和分期相关。
　　【结论】RA患者外周血和炎性微环境中CD4+PD-1+T细胞中OX40的表达异常升高，提示CD4+PD-1+T细胞获得了OX40正性共刺激信号，可能导致其异常活化。CD4+T细胞上PD-1和OX40的表达与RA患者和CIA小鼠临床病理特点相关，提示PD-1和OX40共刺激信号异常可能在自身关节炎的病理进程中发挥重要的作用。
　　第二部分 CD4+CD28-PD-1lowOX40+T细胞亚群在类风湿性和胶原诱导性关节炎疾病进展中的临床病理意义
　　【目的】通过流式细胞技术检测RA患者和CIA小鼠中CD4+T细胞表面CD28、PD-1和OX40的表达，揭示CD4+CD28-PD-1lowOX40+T细胞亚群在自身免疫性关节炎疾病进展中的临床病理意义。
　　【方法】收集71例RA患者外周血样本，选择44例OA患者和47例健康志愿者(HC)作为对照。Ⅱ型胶原(CⅡ)诱导CIA小鼠模型，采用地塞米松(dexamethasone,Dex)腹腔注射进行干预。研究样本的外周血标本使用红细胞裂解液处理，小鼠脾脏通过密度梯度离心法获得单个核细胞。采用免疫荧光染色、流式细胞技术检测RA患者外周血和CIA小鼠脾脏中CD4+T细胞表面CD28、PD-1和OX40的表达，分析CD4+CD28-PD-1lowOX40+T细胞亚群在RA患者和CIA小鼠中的变化。
　　【结果】
　　(1)RA患者和CIA小鼠中CD4+CD28-、CD4+CD28-PD-1low和CD4+CD28-OX40+T细胞亚群比例与对照比较明显升高(p<0.05)。在RA患者外周血CD4+CD28-PD-1low T细胞亚群中OX40+细胞数量与OA患者和HC比较具有显著统计学意义(p=0.035)。
　　(2)与CD4+CD28-PD-1-T细胞亚群比较，CD4+CD28-PD-1low T细胞亚群具有CD45RAlowCD45ROhigh的免疫表型(p<0.01)。
　　(3)临床病理特点相关性分析显示，CD4+CD28-PD-1lowOX40+T细胞亚群与RA患者和CIA小鼠的关节炎评分、疾病活动度以及自身抗体的生成密切相关。在不同临床分期和是否并发关节外表现的患病个体中也存在差异性变化。免疫抑制剂的治疗显著降低CD4+CD28-PD-1lowOX40+T细胞亚群的数量，而随着疾病的复发也显示出异常变化。
　　【结论】在RA患者和CIA小鼠中存在异常变化的CD4+CD28-PD-1lowOX40+T细胞亚群，具有记忆性T细胞的免疫表型，同时与患病个体的临床病理参数密切相关。PD-1和OX40共刺激信号的失衡可能导致CD4+CD28-自身反应性T细胞的长期存活和异常活化，从而参与了自身免疫性关节炎的疾病进展。
　　第三部分可溶性PD-1在类风湿性关节炎中的免疫病理作用及临床意义
　　【目的】检测RA患者血清中可溶性PD-1(sPD-1)的含量，揭示sPD-1在RA患者中的异常表达及临床意义。通过体外刺激及PD-1融合蛋白干预，阐明sPD-1在RA中的免疫病理作用。
　　【方法】收集83例RA患者血清，选取67例OA患者和88例健康志愿者(HC)血清作为对照，通过ELISA测定研究样本血清中sPD-1的含量。密度梯度离心法分离研究样本外周血单个核细胞(PBMCs)，通过Real time RT-PCR检测PBMCs中全长PD-1(flPD-1)和缺失外显子3的PD-1(PD-1Δex3) mRNA的表达。使用细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17体外刺激PBMCs，Real time RT-PCR检测flPD-1和PD-1Δex3 mRNA的表达。分离纯化RA患者CD4+T细胞，体外刺激，流式细胞测定CD4+T细胞表面PD-1的表达；在PD-L1融合蛋白(PD-L1.Fc)包被或PD-L1转基因细胞共培养的T细胞中，加入PD-1融合蛋白(PD-1.Fc)；同时，在PD-L1.Fc包被的T细胞培养体系中加入来自RA、OA患者和HC的热灭活血清或关节滑液。CCK-8试剂盒测定T细胞的增殖。
　　【结果】
　　(1)RA患者血清中sPD-1的含量显著升高，与对照相比具有显著统计学意义(p=0.038)；RA患者外周血PBMCs中PD-1Δex3 mRNA的表达与对照比较也异常升高(p=0.028)；sPD-1的含量与RA患者的疾病活动度、类风湿因子(RF)含量和免疫抑制剂治疗显著相关。
　　(2)细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17刺激在体外对PBMC中flPD-1 mRNA的表达无明显调控作用(p>0.05)，但PD-1Δex3 mRNA的表达在体外受到细胞因子的刺激而显著上调(p<0.05)。
　　(3)CD3体外刺激后，RA患者CD4+T细胞表面PD-1平均荧光强度(MFI)显著低于HC(p<0.05)；PD-L1.Fc对RA患者CD4+T细胞的抑制作用显著低于HC(p<0.05)；PD-1.Fc能够阻断膜性PD-1和PD-L1的结合，明显减弱PD-L1.Fc对T细胞的抑制作用(p<0.05)。
　　(4)添加RA患者的热灭活血清或者关节滑膜液后，CD4+T细胞的增殖效应明显增强(p<0.001)；RA患者的血清或者关节滑液能够明显抵消或者逆转PD-L1.Fc对T细胞的抑制作用(p<0.05)，而在对照血清和滑液中的CD4+T细胞，PD-L1.Fc所介导的抑制作用仍然存在。
　　【结论】在RA患者的血清中存在过度表达的sPD-1，且与患者的临床特点密切相关，提示可被视作RA诊疗新的临床免疫指标。sPD-1和RA患者的炎性介质在体外明显减弱或逆转PD-L1.Fc所介导的T细胞抑制效应，证实在RA中sPD-1阻断了PD-1/PD-L1负性信号导致T细胞活化。
　　综上所述，本研究获得以下研究结果：
　　(1)RA患者外周血、炎性微环境以及CIA小鼠脾脏中CD4+PD-1+T细胞上OX40的表达异常升高，与患病个体的临床病理特点相关。
　　(2)在RA患者和CIA小鼠中存在异常变化的新型CD4+CD28-PD-1lowOX40+T细胞亚群，具有记忆性T细胞的免疫表型，同时与患病个体的疾病进展

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研究背景

参考文献

第一部分 PD-1和OX40在类风湿性和胶原诱导性关节炎CD4+T细胞上的表达

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 CD4+CD28-PD-1lowOX40+T细胞亚群在类风湿性和胶原诱导性关节炎疾病进展中的临床病理意义

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 可溶性PD-1在类风湿性关节炎中的免疫病理作用及临床意义

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文总结与展望

总结

展望

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