RERT-lncRNA中插入缺失多态与肝细胞肝癌易感性关联研究及功能分析

摘要

目的：研究RAB4B-EGLN2通读长链非编码RNA中的一个功能性插入/缺失多态（rs10680577）与中国人群肝细胞肝癌（HCC）易感性的关联，并利用基因型-表型关联研究及分子生物学方法探讨该多态参与肝细胞肝癌发生的功能及意义。
　　方法：（1）运用生物信息学工具查找出RAB4B-EGLN2通读中的多态，并从中选取一个具有潜在功能的四碱基插入/缺失(Indel)多态基因座（rs10680577）作为候选多态；（2）采用病例对照研究方法（1067HCC病例和1692正常对照），PCR扩增结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对候选多态进行基因分型，Logistic回归统计分析基因多态基因座与HCC的关联性；（3）运用Realtime PCR和Western blot研究肝细胞肝癌组织和五种肝细胞株（HepG2,Hep3B,SMMC7721,SK-Hep-1,L02）中rs10680577多态与EGLN2表达量的基因型-表型关联；（4）构建EGLN2启动子报告质粒导入五种肝细胞株做双荧光素酶报告基因测试的方法检测其是否通过影响启动子而发生调节作用；（5）考虑到基因座所处位置，利用生物信息学的方法预测rs10680577多态基因座对RAB4B-EGLN2通读长链非编码RNA（RAB4B-EGLN2 readthrough long non coding RNA, RERT-lncRNA）折叠二级结构的影响;（6）构建RERT-lncRNA-pcDNA3.1(+)真核表达载体并瞬转入三种肝癌细胞株（HepG2, SMMC-7721和sk-Hep-1）检测RERT-lncRNA和EGLN2 mRNA的方法进行功能性验证。
　　结果：（1）基因分型结果显示，位于RAB4B-EGLN2通读内的rs10680577基因座具有较好的多态性，病例组中rs10680577基因座4-bp插入(Ins)和4-bp缺失(Del)的等位基因频率分别为0.759,0.241;正常组则分别为0.819,0.181。病例组和对照组中rs10680577基因座的等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。调整性别、年龄、吸烟、饮酒、HBV感染等主要风险因素后，运用Logistic回归分析的方法对实验数据进行统计分析，统计结果显示：与4-bpIns/Ins纯合子相比，4-bpDel/Del纯合子个体HCC易感性明显增高（OR=2.32，95% C.I.:1.54-3.49, P<0.0001）；等位基因水平分析显示，与Ins等位基因相比，携带Del等位基因的个体患HCC的风险亦明显增高（OR=1.44，95%C.I.:1.26-1.64，P<0.001）。吸烟状态的分层分析发现，这种阳性关联在重度吸烟人群中更显著（Heterogeneity P=0.0002）；（2）rs10680577基因座与EGLN2的基因型-表型关联分析结果显示， Del/Del和Ins/Del基因型组肝癌组织中EGLN2 mRNA的表达较Ins/Ins基因型组明显增高，而邻近的RAB4B mRNA则无明显变化。在四种肝癌细胞株和一种肝细胞株中，携带Del/Del基因型的Hep3B细胞株中EGLN2 mRNA的表达也比携带Ins/Ins基因型的HepG2，sk-Hep-1，SMMC-7721和L02四种细胞株明显增高。Western blot结果显示携带Del/Del基因型的肝癌细胞和组织EGLN2蛋白均比携带Ins/Del和Ins/Ins基因型的细胞和组织增高;（3）构建包含rs10680577插入和缺失等位基因的EGLN2启动子的两种质粒，双荧光素酶报告基因测试结果显示，导入五种细胞株中的两种质粒表达无明显统计学差别;（4）生物信息学预测结果提示，rs10680577多态可使RAB4B-EGLN2通读长链非编码RNA的空间构象存在差别。肝癌细胞和组织中EGLN2和RERT-lncRNA的表达呈强相关(分别为R2=0.823, P=0.034与 R2=0.540, P<0.001)，而且携带缺失等位基因RERT-lncRNA的表达比不携带缺失等位基因显著增高;（5）构建包含rs10680577插入等位基因的RERT-lncRNA pcDNA3.1(+)表达质粒和空质粒并导入HepG2，SMMC-7721和sk-Hep-1三种细胞株，RERT-lncRNA升高4.73-9.82倍，EGLN2升高1.61-1.75倍。
　　结论：（1）中国人群中rs10680577多态与肝细胞肝癌易感性存在显著关联，这种关联在重度吸烟患者中更为明显；（2）肝癌组织中EGLN2的表达量与rs10680577多态之间存在显著的基因型-表型关联；（3）rs10680577多态通过影响RERT-lncRNA的空间构象，从而实现对EGLN2表达的调控，进而参与HCC发生。

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中文摘要

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引 言

第一部分 肝细胞肝癌相关基因RERT-LncRNA插入缺失多态的选取及病例对照的研究

材料与方法

结 果

小 结

第二部分 rs10680577基因型-表型关联分析及功能分析

材料与方法

结 果

小 结

讨 论

结 论

论文创新点

问题与展望

参考文献

综 述

攻读博士学位期间发表论文

附 录

缩略词表

致谢