rAAV2介导hBDNF基因联合游泳训练对脊髓损伤大鼠治疗作用的实验研究

摘要

研究目的：
　　1、构建以绿色荧光蛋白基因（Green fluorescence protein，GFP）为报告基因并携带人脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）基因的2型重组腺相关病毒载体（rAAV2-BDNF-GFP）。
　　2、大鼠脊髓损伤造模成功后，对其进行基因治疗和游泳康复训练，通过对其行为学、组织学和免疫组织化学的分析评价，以及与单一干预方法之间的比较，探讨基因治疗联合游泳康复训练对脊髓损伤的保护作用和影响。
　　研究方法：
　　1、以原有质粒pTRGDNFGFP为模板，构建含有人BDNF cDNA片段的重组质粒pTRBDNFGFP并与AAV病毒包装质粒pAAV-RC、pHelper用PEI法共转染HEK293T细胞。包装获得表达BDNF的2型重组腺相关病毒载体（rAAV2-BDNF-GFP）。
　　2、采用“氯仿处理-PEG/Nacl沉淀-氯仿抽提”3个步骤纯化病毒。SDS-PAGE法检测病毒纯度，并用实时荧光定量PCR检测病毒滴度。重组病毒感染HEK293细胞后，采用Western Blot方法检测细胞BDNF蛋白表达情况。
　　3、90只健康成年雄性SD大鼠随机分为5组，分别为单纯游泳训练组（A组，n=18），单纯基因治疗组（B组，n=18），基因治疗联合游泳训练组（C组，n=18），假手术组（D组，n=18），自然愈合组（E组，n=18）。假手术组大鼠只敲除椎板暴露脊髓即可。其余4组采用改良Allen’s打击法制造大鼠脊髓损伤模型。
　　4、分别在造模前1d，造模后1d、3d、7d、14d、28d、42d对实验大鼠进行后肢运动功能评分（BBB评分和斜扳试验）。造模后14d、28d、42d三个时间点取材，每组随机抽取6只大鼠。取大鼠损伤段脊髓，制作冰冻切片后行HE染色和免疫组织化学染色。
　　5、免疫组化染色切片用图像分析软件Image-pro plus 6.0分析处理。各种统计学处理采用统计学软件SPSS17.0进行分析。
　　研究结果：
　　1、成功构建了重组质粒pTRBDNFGFP；包装制备了2型重组腺相关病毒，纯化浓缩后病毒滴度为6.8331011vp/ml；荧光显微镜下可观察到被病毒感染后的HEK293细胞因表达GFP而发出绿色荧光；Western Blot检测证明被重组病毒感染后的HEK293细胞具有表达BDNF的能力；
　　2、BBB评分和斜板实验结果显示，联合治疗组在14d、28d、42d的各个时间点与单一方法干预组（P<0.05）和自然愈合组（P<0.01）比较均有显著提高，而单一方法干预组与自然愈合组比较也有显著提高（P<0.05）。假手术组在损伤一周后即开始表现出与正常大鼠相似的运动功能。自然愈合组BBB评分和斜扳实验结果有所提高，但没有统计学意义；HE染色切片镜下观察发现联合治疗组、单纯游泳训练组和单纯基因治疗组与自然愈合组相比空洞和瘢痕较少，其中联合治疗组较为明显；脊髓前角运动神经元存活数量统计结果显示，相对于单一方法治疗组和自然愈合组，联合治疗组神经元存活的数量较多（P<0.05）；免疫组化染色结果显示，联合治疗组平均光密度值明显高于其它三组，有显著统计学差异（P<0.05）。
　　研究结论：
　　1、成功包装2型重组腺相关病毒rAAV2-BDNF-GFP。
　　2、rAAV2-BDNF-GFP可以在脊髓组织中稳定的表达BDNF蛋白，有助于轴突的再生，有利于神经元的存活，从而促进损伤脊髓部分功能的恢复。
　　3、合理的游泳训练和基因治疗都可以改善脊髓损伤大鼠的后肢运动功能。
　　4、BDNF基因治疗联合游泳训练组，其治疗效果明显好于单一方法治疗组。
　　5、脊髓损伤是一个非常复杂的病理过程，仅仅依靠单一治疗手段很难达到理想治疗效果，所以联合治疗应该成为脊髓损伤治疗的一种趋势。

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中文摘要

英文摘要

目录

1序言

1.1选题依据

1.2 文献综述

2 实验材料与方法

2.1 实验动物及其分组

2.2 主要试剂和耗材

2.3主要试剂配制

2.4 质粒、细胞、菌株

2.5主要仪器

2.6 实验方法

3实验结果

3.1 重组质粒pTRBDNFGFP的构建结果

3.2 重组腺相关病毒（rAAV2-BDNF-GFP）的扩增、纯化及鉴定结果

3.3 脊髓损伤模型建立情况

3.4行为学评价结果

3.5 组织学观察结果

3.6 各组大鼠脊髓组织中BDNF蛋白的表达情况

4讨论

4.1 重组腺相关病毒载体的制备

4.2脊髓损伤模型的选择

4.3重组腺相关病毒载体（rAAV-BDNF-GFP）在损伤脊髓组织中的表达

4.4 脊髓损伤的病理生理变化及其机制

4.5 游泳康复训练对脊髓损伤的康复作用及其可能机制

4.6基因治疗联合游泳康复训练对脊髓损伤的修复作用

5结论

6全文总结

7 参考文献

8 攻读硕士学位期间公开发表的论文

9 附件

10 致谢