iNKT细胞新配体过氧化物衍生磷脂的表达研究和类风湿性关节炎血清抗体糖基化的研究

摘要

第一章 iNKT细胞新配体过氧化物衍生磷脂的表达研究
　　目的：研究iNKT细胞新配体过氧化物衍生磷脂（PDLs）在哺乳动物胸腺、脾脏、肝脏中的表达情况；探讨它在人骨髓样本中的表达与疾病的关系；比较急性髓细胞白血病患者骨髓样本和急性淋巴瘤白血病与正常对照骨髓样本中PDLs表达水平的差异，进而研究其PDL与NKT功能相关的生物学功能及。
　　方法：(1)采用Folch法提取猪、小鼠、以及人的胸腺中的磷脂，提取小鼠肝脏和脾脏中的磷脂，以及提取正常人骨髓样本、急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病病人骨髓的磷脂；(2)将提取得到的总磷脂进行质谱分析；(3)对所得总磷脂进行质谱定性分析，确定磷脂的的种类及相应子类的结构；(4)对胸腺、肝脏、脾脏、以及骨髓样本中不同种类的磷脂进行相对定量分析：把某种磷脂的相对质谱峰度之和作为分子，把总磷脂的相对质谱峰度之和作为分母，两者的比值即使该种磷脂的相对表达量。(5)对上述相对定量的方法进行方法学验证。
　　结果：(1)通过多级质谱检测技术对各种样本中不同组分的磷脂进行定性分析，发现在哺乳动物的胸腺、肝脏、脾脏以及骨髓样本中，都主要含有12种磷脂，不同种类的磷脂又根据脂肪酸链的长度不同而又分为很多子类(2)我们发现iNKT的新配体PDLs在哺乳动物的胸腺、肝脏、脾脏中都有表达(3)方法学验证试验证明我们所采用的相对定量的方法是可行的(4)我们发现在急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病中，其iNKT新配体PDLs的表达水平均高于正常人。
　　结论：我们采用高精度质谱不仅可以实现不同磷脂的定性分析，而且还可以实现不同磷脂的相对表达量定量分析，通过方法学的验证也能够证明我们这一方法的可行性。不仅如此，我们的实验结果表明，在与免疫系统密切相关的免疫组织胸腺、肝脏、脾脏中都有PDLs的表达，而且在白血病中，PDLs的表达水平均高于正常对照，这一结果为进一步的研究iNKT在免疫系统中的功能作了铺垫。
　　目的：研究血清中抗体的糖基化与类风湿性关节炎（RA）发病之间的密切关系，并从酶学的角度探讨造成这种变化的分子机制，进一步用动物实验来研究酶的变化对动物生长的影响，进而用HPLC来验证我们的假说——RA血清中可能存在识别N-糖变化的免疫球蛋白。
　　方法：(1)对30个正常人和32个病人血清中的总免疫球蛋白进行分离纯化，并进一步用protein G纯化得到IgG；(2)用PNGase F酶处理免疫球蛋白，并纯化得到N糖链；(3)用质谱对N糖链进行结构鉴定，并运用统计学的方法来检测与正常人相比RA病人抗体的糖基化的异常；(4)用ELISA试剂盒检测血清中半乳糖苷酶的变化；(5)动物实验验证半乳糖苷酶对小鼠生长的影响；(6)用HPLC检测RA总免疫球蛋白是否存在抗半乳糖缺失的N糖链的抗体。
　　结果：(1)我们对32个RA病人和30个正常人的抗体N糖链进行了质谱分析，并鉴定了超过50个N糖链；(2)统计学分析发现，在RA病人的抗体N糖链中确实存在半乳糖（Gal）缺失的情况；(3)用 ELISA试剂盒检测发现，RA血清中半乳糖苷酶的表达量明显高于正常人；(4)用商品化的半乳糖苷酶腹腔注射到小鼠体内，我们发现半乳糖苷酶的注射能够明显降解 N-糖链末端的 Gal，并且能够让血清中的类风湿性因子（RF）上升；(5)用HPLC检测发现RA总免疫球蛋白与末端缺失Gal的N糖标准品共培养物，我们发现RA血清中存在专一性识别末端缺失Gal的N糖的免疫球蛋白。
　　结论：本课题基于质谱对N糖链的结构鉴定进一步证实RA抗体的N糖链确实存在半乳糖缺失的现象，而造成这种缺失可能是因为由于半乳糖苷酶的表达量上升。进一步的动物实验表明，在动物体内，半乳糖苷酶降解掉 N糖末端的 Gal以后，能够有效的促进 RF因子含量的上升；不仅如此，我们用 HPLC还发现在RA中存在识别末端缺失Gal的N糖链的免疫球蛋白。

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引 言

参考文献

第一章 iNKT细胞新配体过氧化物衍生磷脂的表达研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二章 类风湿性关节炎抗体糖基化的研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

综 述

攻读学位期间公开发表的论文、专利

附 录

中英文缩略词汇表

致谢