miR-31调控靶基因SATB2改变肺癌细胞功能的实验研究

摘要

目的:筛选出转移性肺癌患者血清中异常表达的miRNAs，测定其在肺癌细胞系中的表达情况，并验证其作用靶点。探讨miR-31调控靶基因SATB2改变肺癌细胞迁移和侵袭能力的作用机制。
　　方法:
　　第一部分建立基于实时荧光定量PCR检测肺癌患者血清miRNAs的方法，用该法检测61例肺癌患者血清（其中26例有远处转移）中9种miRNAs（miR-20a、miR-21、miR-25、miR-29a、miR-31、miR-126、miR-129、miR-145、miR-205）的表达情况。
　　第二部分应用生物信息学预测软件TargetScan、mirBase和PicTar对miR-31靶基因进行预测,选定靶基因SATB2的3'UTR区克隆到PGL3-control荧光素酶报告基因载体下游,通过双荧光素酶报告基因检测miR-31对靶基因SATB2的3'UTR区的调控能力。将miR-31 mimics/inhibitors瞬时转染人肺腺癌细胞95D（人高转移肺腺癌细胞），通过Western blot检测miR-31对SATB2蛋白表达的影响。
　　第三部分应用Real-time PCR对肺支气管上皮细胞（HBE）及肺腺癌细胞株（A549、H1299、95C和95D）内的miR-31作定量检测。通过Western blot检测人肺癌细胞系中SATB2的表达，选择SATB2蛋白表达最高的肺腺癌细胞株（95D）。建立过表达或抑制miR-31的人肺腺癌95D细胞系，同时建立抑制SATB2的人肺腺癌95D细胞系，应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的变化，利用单层伤口愈合实验和transwell小室检测肺腺癌95D细胞迁移和侵袭能力的改变。
　　结果:
　　第一部分实时荧光定量PCR检测出miR-31结果提示:在肺癌血清标本中当有远处转移时其表达水平显著降低（t=3.320，P=0.002），其表达差异具有统计学意义。
　　第二部分成功构建SATB2的3'UTR区表达载体PGL3-SATB2。双荧光素酶报告基因分析表明miR-31能够作用于SATB2的3'UTR。通过Western blot，与对照组相比，转染miR-31 mimics组的SATB2的蛋白表达降低，而转染miR-31 inhibitors组的SATB2的蛋白表达升高，进一步证实SATB2是miR-31的靶基因。
　　第三部分以人肺支气管上皮细胞HBE作为对照，在四种肺腺癌细胞株A549、H1299、95C和95D中， miR-31的表达水平在95D（人高转移肺腺癌细胞）细胞系中是最低的（F=6.976,P=0.001），其表达差异具有统计学意义。Western blot结果表明SATB2在高转移潜能的人肺腺癌细胞株95D中表达最高。miR-31与SATB2的表达呈负相关。在人肺腺癌细胞95D中过表达miR-31及抑制SATB2后降低细胞的迁移和侵袭能力，而抑制miR-31的表达则会增强细胞的迁移和侵袭能力。但在95D细胞中改变miR-31的表达对细胞增殖作用不大。
　　结论:初步筛选与转移性肺癌相关的miRNAs。miR-31可能是转移性肺癌的标记性miRNAs之一。SATB2是其作用靶点，miR-31作用于SATB2的3'UTR可在转录后水平上调控SATB2蛋白的表达。miR-31在高转移能力的人肺腺癌细胞95D中呈低表达,具有类似抑癌基因的作用调控SATB2的表达,降低了人肺腺癌细胞95D的迁移和侵袭能力，SATB2是miR-31的靶基因，有望成为肿瘤生物治疗的一个靶点。

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封面

中文摘要

英文摘要

目录

前 言

第一部分 实时荧光定量PCR检测miRNAs在转移性肺癌患者血清中的表达

1 材料和方法

2 结 果

3讨 论

参考文献

第二部分 SATB2的3'UTR区荧光素酶报告基因载体的构建及miR-31靶基因验证

1材料和方法

2结 果

3讨 论

参考文献

第三部分 miR-31调控SATB2靶基因改变肺腺癌95D细胞的迁移和侵袭能力的实验研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

总 结

综 述

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