基于蛋白质反式剪接在大肠杆菌中重组鲎C因子Sushi多肽

摘要

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外层上特有的结构，其化学成分为脂多糖（LPS）。细菌内毒素可引起人体发热、休克甚至死亡，但它又普遍存在且不易灭活，对制药和医疗器械行业是一个挑战，临床上也有必要应用可靠灵敏的内毒素检测试剂来避免内毒素带来的不良反应。
　　鲎试剂（LAL/TAL）是国际上至今为止检测内毒素最好的方法，具有简单、快速、灵敏度高等特点，可检测出fg（10-15g）级水平的内毒素，已被广泛用于药物，外科器械、水和食品中内毒素检测。然而由于近年来日益广泛的鲎资源应用，再加上海洋环境污染等原因，鲎资源濒临枯竭，迫切需要开发鲎试剂的替代品。
　　基因工程成为开发鲎试剂首选的研究平台，但由于细菌壁含有内毒素，最经济实用的大肠杆菌系统不容易被利用，蛋白质内含子介导的蛋白质剪接技术应运而生，存在于前体蛋白质中的内含子会在蛋白质翻译后发生自我剪切，并以天然肽键连接两侧蛋白质外显子形成成熟的蛋白质。
　　鲎C因子是鲎血细胞中一种对内毒素具有高亲和力的丝氨酸蛋白酶原，可替代鲎试剂用于内毒素检测。鲎C因子N端CES片段中的Sushi区域是与内毒素结合的关键部位。本文主要介绍了运用蛋白质反式剪接的新技术重组表达鲎C因子Sushi多肽，在特定位点断开鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段，分别连接到断裂蛋白质内含子Ssp DnaX的N端片段(IN)和C端片段(IC)在大肠杆菌中表达，表达产物经亲和层析纯化，复性以及内毒素去除后，体外诱导该蛋白质内含子发生剪切，得到C因子中CES12片段，并检测其活性。实验结果表明此重组Sushi多肽具有内毒素结合活性，提示在大肠杆菌系统中低成本地开发内毒素检测试剂的可行性。

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前 言

1本课题的研究背景

2 内毒素及其检测

3 鲎C因子作为内毒素检测试剂的开发

4 蛋白质反式剪接及其在蛋白质工程领域的应用

5本课题的意义及研究主要内容

实验材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验技术与方法

结果与讨论

1Sushi基因片段的筛选和基因构建

2 His-DnaX-CES12-N/C融合蛋白的表达和纯化和复性

3 体外蛋白反式剪接反应

4 动态荧光浊度法检测剪接产物内毒素结合活性

结 论

参考文献

附 录

攻读学位期间公开发表的论文

致谢