ENG基因近端启动子区及5’-UTR区甲基化与非小细胞肺癌关系的研究

摘要

【背景与目的】
　　肺癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居各类肿瘤死亡原因之首。肺癌按组织病理学可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌(SCLC)两大类，前者占肺癌患者总数85%以上。肺癌的发生发展过程中，TGF-β信号通路发挥了极其重要的作用。TGF-β在肿瘤早期有抑制肿瘤细胞生长发育的抑癌作用，但在恶性肿瘤晚期反而促进肿瘤转移播散起着促癌作用。ENG基因编码的endoglin蛋白是TGF-β受体复合物重要组成部分，通过ALK1和ALK5增强smad1、smad2而抑制smad3通路。DNA的甲基化是导致基因表达或者沉默的最典型表观机制，并且与肺癌的发生发展密切相关。本研究主要目的是，了解ENG基因在非小细胞肺癌中mRNA、蛋白表达水平，并进一步探索其表达差异与ENG基因近端启动子区及5’-UTR区甲基化状态之间的关系，旨在为非小细胞肺癌早期诊断、转移复发、疗效评估、生存预后提供一定理论依据。
　　【方法】
　　利用荧光实时定量 PCR（Real-Time PCR）检测人支气管上皮细胞株(HBE)和4株非小细胞肺癌细胞株（A549、H1299、95C和95D）以及22对NSCLC癌与癌旁组织标本中ENG基因mRNA表达水平；并运用western blot方法检测ENG在上述样本中蛋白表达水平；采用BSP和TA克隆测序方法对5株细胞（HBE、A549、H1299、95C和95D）以及3对IV期NSCLC癌与癌旁组织标本ENG基因近端启动子区和5’-UTR区 CpG位点甲基化状态进行分析；选取 A549、95D细胞株，利用5-Aza-2’-deoxycytidine去甲基化药物处理细胞，再次运用荧光实时定量 PCR方法检测药物处理组与未处理对照组细胞株中ENG的表达差异，并进一步利用BSP和TA克隆测序方法分析药物处理组细胞株5’-UTR区CpG位点甲基化状态。
　　【结果】
　　1.荧光实时定量 PCR实验结果显示，ENG基因 mRNA在高转移性肺癌细胞H1299、95D细胞株中高表达，而在人正常支气管上皮细胞株 HBE和低转移性肺癌细胞A549、95C细胞株中表达缺失，且H1299和95D中的相对表达量之间存在显著性差异(P<0.001)；在22对NSCLC癌与癌旁组织标本中，ENG基因mRNA在19/22例癌组织中显著高表达(P<0.0001),并与肺癌淋巴结转移有关（P=0.02）;Western blot实验结果表明，ENG基因编码蛋白endoglin在上述样本中的表达水平与mRNA表达水平一致。实验结果提示ENG基因高表达可能与非小细胞肺癌的恶性转移程度相关。
　　2. ENG基因近端启动子区和5’-UTR区共2414bp， CpG位点68个，5’-UTR区含有1个CpG岛。BSP结果显示ENG启动子区散在的10/37个CpG位点甲基化频率存在显著差异(P<0.05)，5’-UTR区CpG岛除了+130位点以外的27个CpG位点甲基化频率均存在显著差异(P<0.05)。结合细胞株中ENG表达量情况分析发现CpG岛甲基化与ENG表达量呈反比。
　　3.去甲基化药物5-Aza-2’-deoxycytidine处理A549、95D细胞后，BSP和TA克隆测序实验观察ENG基因5’-UTR区CpG岛位点甲基化情况，发现该区域在A549和95D细胞株中甲基化频率均下调；荧光实时定量PCR和western blot实验结果均显示ENG基因在95D细胞株中表达量下调（P<0.0001），而在A549细胞株中无明显变化。
　　【结论】
　　1. ENG基因mRNA及蛋白水平在转移性恶性肺癌细胞株及NSCLC癌组织中表达上调，检测ENG的表达水平有助于NSCLC的早期诊断，并对NSCLC的复发转移及预后可能有一定的预测价值。
　　2. ENG基因表达量与ENG基因5’-UTR区CpG位点甲基化呈反比,说明DNA甲基化是调节ENG表达的重要机制。
　　3. ENG基因去甲基化药物处理有效，恶性转移性肺癌细胞株中ENG基因表达下调，为临床化学药物治疗NSCLC提供了新的靶点。

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封面

中文摘要

英文摘要

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引 言

一、肺癌现状介绍

二、表观遗传学

三、DNA甲基化与肿瘤发生的研究进展

四、ENG基因与肿瘤研究进展

一、前言

二、材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

三、结果

3.1 细胞中ENG基因mRNA的表达情况

3.2 细胞中endoglin蛋白的表达情况

3.3 ENG基因在组织样本中的表达情况

3.4 ENG基因近端启动子区及5’-UTR区的DNA甲基化情况

3.5 ENG基因去甲基化药物处理

四、讨论

参考文献

英文对照简写表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢