联合转染反义寡核苷酸Survivin和VEGF抑制肺癌A549细胞生长的研究

摘要

目的：本实验针对Survivin和VEGF mRNA序列设计反义寡核苷酸（ASODN），以脂质体（Lip）为载体，应用Survivin和VEGF ASODN联合转染非小细胞肺癌A549细胞株，探讨同时抑制Survivin和VEGF两个基因对肺癌细胞增殖、凋亡以及基因表达的影响，为非小细胞肺癌双靶点基因治疗提供实验依据。
　　方法：①将实验分为7组，Blank组：A549细胞；Lip组：Lipofectamine2000转染A549细胞；Survivin SODN组；VEGF SODN组；Survivin ASODN；VEGF ASODN；Survivin+VEGF组：Survivin ASODN和VEGF ASODN联合转染A549细胞。②利用反义寡核苷酸技术，以脂质体（Lip）为载体，分别介导200、400、600nmol/L Survivin ASODN和5、10、20μmol/L VEGF ASODN单独转染A549细胞，镜下观察转染后的细胞形态变化，转染24h、48h、72h、96h后，MTT法检测细胞生长抑制率，RT-PCR测定细胞中Survivin和VEGF基因mRNA表达。③用脂质体介导400nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN联合转染A549细胞，48h后观察联合转染组细胞形态变化，MTT检测细胞增殖情况，RT-PCR检测Survivin和VEGF mRNA表达，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡和Survivin蛋白表达。
　　结果：①显微镜下Blank组、Lip组、SODN组细胞形态完整、贴壁良好，ASODN组细胞形态不规则、生长减慢，Survivin+VEGF组细胞皱缩、成簇状漂浮；② MTT结果显示A549细胞分别经200、400、600nmol/L Survivin ASODN和5、10、20μmol/L VEGF ASODN转染，孵育24h，48h，72h，96h后细胞生长出现不同程度的抑制，与Blank组、Lip组、SODN组相比，细胞增殖抑制率显著升高（P<0.05）；且Survivin ASODN和VEGF ASODN抑制作用均在48h达到高峰，随孵育时间增加，抑制作用逐渐减弱；③ ASODN组抑制作用呈剂量依赖性，其中Survivin ASODN在400nmol/L浓度处出现明显的抑制效果，细胞增殖抑制率为（49.24±1.15）%，与200nmol/L（39.54±1.93）%相比显著增高（P<0.05），mRNA相对含量明显降低（P<0.05）；VEGF ASODN在10μmol/L浓度处出现明显的抑制效应，抑制率为（39.54±1.44）%，抑制作用比浓度为5μmol/L（27.47±1.30）%时明显增强，mRNA表达也显著降低，两者差异均具有统计学意义（P<0.05）；④400nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN转染 A549细胞48h后， Survivin+VEGF组的细胞生长抑制率为（61.37±1.94）%，较单独转染 Survivin ASODN（50.44±1.13）%和 VEGF ASODN（39.33±1.99）%的抑制效果明显增加(P＜0.05)；⑤ Annexin V-FITC/PI双标记细胞后流式细胞仪检测Survivin+VEGF组 A549细胞凋亡率为（57.03±1.61）%，显著高于Survivin ASODN（22.33±2.41）%和VEGF ASODN（18.28±1.13）%单独转染组，差异具有统计学意义(P＜0.05)；⑥ RT-PCR结果显示 Survivin+VEGF组 Survivin mRNA和VEGF mRNA相对含量分别为（15.26±1.31）%和（13.12±1.45）%，较Blank组、Lip组、SODN组、ASODN组显著降低（P<0.01），ASODN组中单个基因被抑制，另一基因 mRNA表达也出现下调；⑦流式检测 Survivin蛋白表达率， Survivin+VEGF组为（30.40±1.33）%、Survivin ASODN组为（41.41±1.19）%、VEGF ASODN组为（46.84±1.72）%，双基因ASODN联合转染对Survivin蛋白表达的抑制强度明显高于单独转染组（P<0.05），此外，Survivin蛋白的表达在VEGF ASODN组也明显减少（P<0.05）。
　　结论：Survivin和VEGF ASODN联合转染能够抑制A549细胞增殖，促进细胞凋亡，同时显著降低Survivin和VEGF mRNA以及Survivin蛋白的表达，两基因反义寡核苷酸联合转染的效果明显优于Survivin ASODN和VEGF ASODN单独转染。

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前 言

实验流程

第一部分 Survivin ASODN和VEGF ASODN转染肺癌A549细胞最佳作用浓度和作用时间的筛选

1. 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 联合转染Survivin ASODN和VEGF ASODN抑制肺癌A549细胞的生长

1 材料

2 方法：

3 结果

4 讨论

结 论

参考文献

综述：反义寡核苷酸技术在基因治疗中的研究进展

中英文对照缩略词表

致谢