Ad-ING4-OSM双基因共表达对SPC-A1肺腺癌移植瘤的抑瘤增效和放疗增敏的实验研究

摘要

目的：研究腺病毒介导的ING4和OSM双基因共表达对SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤增效和放疗增敏作用及其分子机制。
　　方法：构建 AdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter(简称 Ad-ING4)、AdTrack-CMV-poly-A-promoter-OSM(简称 Ad-OSM)、 AdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM(简称 Ad-ING4-OSM)单双基因重组病毒，将上述病毒转染QBI-293A细胞，经多轮感染扩增、纯化后测定效价，-80℃保存备用。用RT-PCR鉴定ING4/OSM基因在QBI-293A细胞中的有效表达。培养SPC-A1肺腺癌细胞，建立SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤模型。对已成瘤的裸鼠随机分组，共七组，分别是：PBS组、Ad组、ING4组、OSM组、放疗组、ING4/OSM双基因组、ING4/OSM+放疗组。对各组裸鼠进行抗肿瘤实验，方案如下：（1）PBS组：瘤内多点注射 PBS液，剂量100ul/只,隔日一次，共五次；（2）Ad组、Ad-ING4组、Ad-OSM组、Ad-ING4/OSM双基因组:瘤内多点注射各重组腺病毒，剂量为1.0*108/100 ul/只,隔日一次，共五次；（3）放疗组：抗肿瘤实验的第0 d对裸鼠进行局部瘤体照射，剂量为10Gy/只，共一次；（4）Ad-ING4/OSM+放疗组：瘤体内多点注射Ad-ING4/OSM双基因重组病毒，剂量剂量为1.0*108/100 ul/只，隔日一次，共五次；治疗5d后局部进行瘤体照射，照射剂量同放疗组。抗肿瘤实验开始后隔日用游标卡尺测量各瘤体长、短径，计算体积，绘制瘤体体积-时间曲线，观察抑瘤效果，治疗结束5d后处死裸鼠摘取瘤体，称重，计算抑瘤率，将摘取的瘤体切片，HE染色观察各治疗组的细胞凋亡情况，免疫组化检测凋亡相关蛋白及肿瘤血管形成相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fasl、Survivin、VEGF的表达。
　　结果：成功构建了载有ING4和OSM单双基因的重组腺病毒,各重组病毒效价均达到1.0~2.0*109/ml的病毒。RT-PCR证实ING4/OSM能够在QBI-293A细胞中有效表达。裸鼠模型的抗肿瘤实验证实Ad-ING4、Ad-OSM、放疗组、Ad-ING4-OSM、Ad-ING4-OSM联合放疗组均对肺腺癌SPC-A1裸鼠移植瘤有不同程度的抑制作用，且与PBS组、Ad-GFP空载体腺病毒组比较有显著统计学意义（P＜0.01）， Ad-ING4-OSM基因组的抑瘤效应明显优于Ad-ING4和Ad-OSM基因组，呈现抑瘤叠加效应（Q=1.10），而双基因联合放疗组抑瘤效应最强，呈现放疗增敏效应（Q=1.04）。HE染色下观察凋亡情况,不仅双基因组较单基因组、Ad组、PBS组细胞凋亡明显，而且双基因联合放疗组较双基因组、单独放疗组凋亡更明显。分子机制检测结果表明：Ad-ING4、Ad-OSM、放疗组、Ad-ING4-OSM、Ad-ING4-OSM+放疗组不仅均能明显上调SPC-A1肺腺癌细胞促凋亡因子Bax、Caspase-3、FASL的表达，并下调抑制凋亡的Bcl-2、Survivin蛋白的表达，而且还能明显下调肿瘤血管形成因子VEGF的表达，双基因组较单基因组、Ad组、PBS组调节上述因子的效果更明显（P＜0.01），双基因联合放疗优于单独放疗组、双基因组（P＜0.01）。
　　结论：（1）成功构建各基因重组腺病毒，并扩增获得大量高纯度、高滴度的病毒液；（2）体内实验证实腺病毒介导的ING4/OSM双基因共表达对SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤具有明显的抑瘤增效和放疗增敏作用；（3）抑瘤的分子机制可能与上调SPC-A1肺腺癌细胞促凋亡因子Bax、Caspase-3、Fasl的表达、下调抑制凋亡的Bcl-2、Survivin蛋白的表达及下调肿瘤血管形成因子VEGF的表达有关。
　　本实验证实ING4/OSM双基因对肺癌的治疗效果优于单基因，具抑瘤增效作用，且联合放疗的治疗效果最佳，具放疗增敏效应，是理想的放疗增敏剂，为今后临床应用双基因联合放疗的治疗方案提供了有效的实验依据。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

前 言

参考文献

第一部分 基因重组腺病毒载体的构建及其检测

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分 Ad-ING4-OSM双基因对人肺腺癌SPC-A1移植瘤抑瘤增效及其分子机制的实验研究

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第三部分 Ad-ING4-OSM联合放疗对裸鼠人肺腺癌移植瘤放疗增敏效应及其分子机制的实验研究

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

结 论

综 述

攻读学位期间发表论文和待发表的文章

对照缩略词语

致谢