重组人促红细胞生成素对大鼠创伤性脑损伤血管新生的影响及相关机制研究

摘要

创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)是导致患者死亡和长期残疾的主要病因之一,按照病理过程包括原发性损伤(Primary brain injury)和继发性损伤(Secondary brain injury, SBI)。原发性颅脑损伤与外界直接作用有关,难以干预。SBI发生于颅脑损伤后数小时至数天,包括线粒体功能的障碍、炎性反应和细胞坏死、凋亡等,最终导致脑缺血、脑梗死、脑水肿等不良预后,是颅脑损伤患者死亡和致残的主要原因。然而,研究发现,约90％的TBI患者有缺血性改变,缺血缺氧又往往伴随出现,所以TBI后的局部缺血缺氧就成为SBI发生、发展的主要机制之一,血管作为供血、供氧的基本结构,血管新生的相关研究就成为科研工作者和临床医师的研究的热点。
　　血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)作为一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素,可以通过与内皮细胞上的两种受体KDR和Flt-1高亲和力结合,一方面直接刺激血管内皮细胞增殖,诱导其迁移和形成官腔样结构;另一方面增加微血管通透性,引起血浆蛋白(主要是纤维蛋白原)外渗,并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成。血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31)作为血管内皮的重要标记物,对新生血管内皮细胞的标记的特异性很强,并参与血管新生过程,可以有效地反应血管新生的程度。
　　近年来的研究证实,促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)对脑创伤、脑卒中、缺血等疾病具有保护性治疗作用,但其具体机制尚不清楚。重组人促红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin,rhEPO)是一种通过使用重组DNA技术生产的、含有与天然分离的EPO完全相同氨基酸序列的糖蛋白,与天然EPO具有相同的生物学特性。Nakano M等人就曾通过小鼠缺血再灌注损伤模型研究得出EPO诱导VEGF产生,进一步促进血管生成的结论。
　　我们假设rhEPO的这种促血管形成作用在大鼠TBI模型中同样适用,那么TBI后rhEPO的干预可能会成为一种新的改善脑外伤预后的治疗方法。
　　第一部分重组人促红细胞生成素对创伤性脑损伤大鼠VEGF分泌及血管新生的影响
　　目的:通过观察应用促红细胞生成素(rhEPO)对大鼠TBI后,不同时间点挫伤灶及周围脑组织VEGF和CD31的表达变化,探讨rhEPO对TBI后血管新生的影响。
　　方法:成年健康雄性SD大鼠90只,随机分为对照组(Sham组,n=6只)、颅脑损伤组(TBI组,n=42只)和rhEPO干预组(TBI-rhEPO组,n=42只)。通过改良Feeney法建立颅脑损伤(TBI)模型,按伤后留取标本时间分为TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-5d、TBI-7d、TBI-10d和TBI-14d共7个亚组,每亚组各6只,用正常大鼠作为Sham组,TBI-rhEPO组造模后即刻腹腔注射rhEPO注射液(3000 IU/kg)及生理盐水(0.5mg/kg)(用作实验第二部分对照),以后每天同一时间点给药一次,Sham组及TBI组于同一时间点腹腔注射等量生理盐水,直至动物被处死。于预定时间点行神经功能损伤评分(NSS),每亚组随机取三只大鼠处死后取挫伤灶及周围脑组织通过PT-PCR检测VEGF、CD31 mRNA表达情况;剩余的3只大鼠采用HE染色观察伤后病灶的病理变化,采用免疫组织化学方法(SP法)检测挫伤灶及周围脑组织中VEGF和CD31蛋白的表达情况,应用显微图像分析系统计算阳性细胞并测定其平均光密度值。
　　结果:(1)RT-PCR sham组SD大鼠脑组织未检测到VEGF及CD31 mRNA明显表达,TBI后挫伤灶及周围脑组织VEGF、CD31 mRNA的表达均在TBI-6h开始升高,至TBI-3d表达量达到峰值,随后均呈下降趋势,至TBI-14天表达稍减弱,但仍为高表达状态,而VEGF、CD31 mRNA的表达呈正相关(r=0.9239,P<0.001),与TBI组比较, TBI-rhEPO组不同时间点大鼠脑组织VEGF及CD31 mRNA表达量均明显升高(P<0.05);(2)免疫组化 sham组大鼠脑组织未检测到VEGF及CD31蛋白的明显表达,颅脑损伤后挫伤灶及周围脑组织VEGF、CD31蛋白的表达均在TBI-6h开始表达,至TBI-5d至表达高峰,并持续高表达至TBI-10d,至TBI-14d稍下降,但仍处于高表达状态。与TBI组比较,TBI-rhEPO组不同时间点挫伤灶及周围脑组织VEGF和CD31蛋白表达均明显升高(P<0.05),且VEGF蛋白表达与CD31蛋白表达呈正相关(r=0.9813, P<0.001);(3)神经功能评分(NSS) sham组SD大鼠NSS评分为0分,颅脑损伤后, TBI-rhEPO组和TBI组NSS评分均随着时间的推移而逐渐下降,但TBI-rhEPO组下降更明显,且在TBI-24h~TBI-14d,TBI-rhEPO组NSS明显低于TBI组,与TBI组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论:颅脑损伤早期应用rhEPO,可通过上调VEGF和CD31的表达,进而起到对大鼠颅脑损伤的保护作用。注重于血管新生的靶向治疗,可一定程度减轻挫伤灶及周围脑组织缺血缺氧,阻止脑水肿、脑梗死等不良预后的发生发展,达到改善脑外伤预后的目的。
　　第二部分重组人促红细胞生成素促进创伤性脑损伤大鼠血管新生的相关机制研究
　　目的:通过观察予以渥曼青霉素(wortmannin)干预的TBI后大鼠损伤灶及周围脑组织中VEGF和CD31的表达变化,探讨rhEPO促进TBI后大鼠血管新生的可能机制。
　　方法:42只健康雄性SD大鼠通过改良Feeney法建立TBI模型后,即刻腹腔注射重组人促红细胞生成素(rhEPO)注射液(3000IU/kg)及wortmannin(0.5mg/kg),以后每天同一时间点给药一次,直至动物被处死,记为TBI-WM组,根据伤后处死时间随机分为TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-5d、TBI-7d、TBI-10d和TBI-14d共7个亚组,每亚组各6只。于预定时间点行神经功能损伤评分(NSS),每亚组随机取三只大鼠处死后取挫伤灶及周围脑组织通过PT-PCR检测VEGF、CD31 mRNA表达情况;剩余的3只大鼠采用HE染色观察伤后病灶的病理变化,采用免疫组织化学方法(SP法)检测挫伤灶及周围脑组织中VEGF和CD31蛋白的表达情况,应用显微图像分析系统计算阳性细胞并测定其平均光密度值。第一部分实验中TBI组及TBI-rhEPO组作为本部分实验对照组。
　　结果:(1)RT-PCR TBI-rhEPO组SD大鼠挫伤灶及周围脑组织VEGF、CD31 mRNA的表达,在TBI-6h开始升高,至TBI-3d表达量达到峰值,随后呈下降趋势,至TBI-14d表达稍减弱,但仍为高表达状态;与TBI-rhEPO组比较,TBI-WM组不同时间点大鼠脑组织VEGF及CD31 mRNA表达量均明显下降(P<0.05);(2)免疫组化 TBI-rhEPO组SD大鼠脑组织VEGF和CD31的表达,在TBI-6 h开始表达, TBI-5d表达量达到高峰,高表达持续至TBI-10d,至TBI-14d稍下降,但表达量仍较高,TBI-WM组不同时间点挫伤灶及周围脑组织VEGF和CD31蛋白表达均明显下降(P<0.05);(3)神经功能评分(NSS) TBI-rhEPO组和TBI-WM组NSS均随着时间的推移而逐渐下降,但TBI-rhEPO组下降更明显,且在伤后24h~14d,TBI-rhEPO组NSS明显低于TBI-WM组,与TBI-WM组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论:rhEPO保护性治疗作用的可能机制是:通过磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K/Akt)途径,上调VEGF的表达,促进脑血管新生,从而发挥神经保护作用。

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引言

第一部分 重组人促红细胞生成素对创伤性脑损伤大鼠VEGF分泌及血管新生的影响

1. 实验材料

1.1 主要实验设备和仪器

1.2 主要试剂及相关耗材

1.3 实验动物的选择与分组

2. 实验方法

2.1 自制自由落体装置建立大鼠闭合性颅脑损伤模型

2.2 颅脑损伤后的神经功能评分

2.3 组织标本取材

2.4 RT--PCR检测脑组织中VEGF、CD31 mRNA相对表达量

2.5 HE染色及SP法免疫组化检测脑组织中VEGF、CD31蛋白的表达

2.6 统计学分析

3. 结 果

3.1 大鼠颅脑损伤模型结果

3.2 RT-PCR检测脑组织中VEGF、CD31mRNA的相对表达量

3.3 免疫组化（SP法）检测脑组织中VEGF、CD31蛋白的表达情况

3.4 颅脑损伤后不同时间点大鼠NSS评分比较

4. 讨 论

4.1 颅脑损伤模型

4.2 促红细胞生成素和重组人促红细胞生成素

4.3 VEGF在颅脑损伤后继发性颅脑损伤中的表达

4.4 CD31在颅脑损伤后继发性颅脑损伤中的表达

4.5 TBI后应用rhEPO对大鼠VEGF分泌及血管新生的影响

4.6 TBI后应用rhEPO对大鼠血管新生的可能机制

第二部分 重组人促红细胞生成素促进创伤性脑损伤大鼠血管新生的相关机制研究

1. 实验材料

1.1 主要实验设备和仪器：同第一部分。

1.2 主要试剂：

1.3 实验动物及分组

2. 实验方法

2.1 动物模型的制作

2.2 组织的的取材与固定：

2.3 RT--PCR检测脑组织中VEGF、CD31 mRNA相对表达量：

2.4 HE染色及SP法免疫组化检测脑组织中VEGF、CD31蛋白的表达：

2.5 统计学分析：

3. 结 果

3.1 颅脑损伤后不同时间点HE染色的变化

3.2 RT-PCR检测脑组织中VEGF、CD31mRNA的相对表达量

3.3 TBI后损伤灶及周围脑组织中VEGF、CD31蛋白表达的变化

3.1 神经功能评分

4. 讨 论

4.1 磷脂酰肌醇3激酶 (phosphatidyli-nositol 3-kinase，PI3K)信号通路

4.2 PI3K抑制剂干预对rhEPO应用后TBI大鼠挫伤灶及周围脑组织VEGF表达的影响

4.3 PI3K抑制剂干预对rhEPO应用后TBI大鼠挫伤灶及周围脑组织CD31表达的影响

研究小结

综述

参考文献

中英文缩略词表

攻读学位期间发表的论文

致谢