γ-氨基丁酸A受体α1和γ2亚单位调质对未成熟鼠反复惊厥发作的远期作用

摘要

目的:探讨γ-氨基丁酸A受体(GABA(A)受体)调质(激动剂氯硝西泮(CZP)与拮抗剂氟马西尼(FMZ))对未成熟鼠反复惊厥(Recurrent seizures,RS)发作后,海马内GABA(A)受体α1和γ2亚单位的表达变化及其远期神经行为学影响,以了解GABA(A)受体调质在未成熟鼠惊厥脑损伤中的干预作用及其意义。
　　方法:出生5d(Postnatal day5,用P5表示,下同)的健康Waster大鼠160只,随机分为五组:正常对照组(CONT组,n=32)、惊厥组(RS组,n=32)、惊厥后生理盐水干预组(NS干预组,n=32)、惊厥后氯硝西泮干预组(CZP干预组,n=32),惊厥后氟马西尼干预组(FMZ干预组,n=32)。除CONT组外其余四组惊厥动物模型为每日反复吸入三氟乙醚诱导大鼠惊厥发作5次,每两次间隔时间2h,连续5d;CONT组大鼠进行同样的操作但不吸入三氟乙醚。CZP干预组和FMZ干预组大鼠于惊厥结束后1d起分别给予氯硝西泮6.0mg/(kg·d)、氟马西尼1.0mg/(kg·d)干预,连续5d;NS干预组大鼠于惊厥结束后1d起给予等量生理盐水灌胃干预,连续5d。在不同的时间通过负趋地性、前肢悬挂、平面翻正、悬崖回避实验、旷场实验、平衡木实验以及Morris水迷宫实验等进行评价其神经行为情况;并将各组大鼠分别于末次干预后当天(即P15)及20d(即P35)、55d(即P70)留取海马组织,采用免疫印迹技术及荧光定量RT-PCR法分别测定大鼠海马GABA(A)受体α1和γ2亚单位的表达。
　　结果:1、神经行为学检测结果:(1)悬崖回避实验:RS组及NS干预组大鼠从木板边缘退回或转身所需的时间较CONT组均明显延长(P<0.05);CZP干预组大鼠从木板边缘退回或转身所需的时间较NS干预组均明显延长(P<0.05);FMZ干预组大鼠从木板边缘退回或转身所需的时间较NS干预组无显著性差异(P>0.05);(2)负趋地性实验:RS组及NS干预组大鼠倒转180°所需时间较CONT组明显延长(P<0.05)。CZP干预组大鼠倒转180°所需时间较NS干预组均明显延长(P<0.05);FMZ干预组大鼠倒转180°所需时间较NS干预组明比较无显著性差异(P>0.05);(3)旷场试验表明,中央格停留时间CZP干预组大鼠较NS干预组均明显延长(P<0.05);中央格停留时间FMZ干预组大鼠较NS干预组无显著性差异;跨越方格数CZP干预组大鼠较NS干预组均显著减少(P<0.01)。跨越方格数FMZ干预组大鼠较NS干预组无显著性差异(P>0.05);(4)平衡木试验提示,RS组及NS干预组大鼠平均评分均明显低于CONT组(P<0.05),CZP干预组大鼠较NS干预组评分均明显降低(P<0.05)。FMZ干预组大鼠较NS干预组评分无显著性差异(P>0.05)。
　　2、学习记忆能力(Morris水迷宫检测结果):(1)登台潜伏期:经过连续5天(P61-P65)定位航行试验,五组鼠的逃避潜伏期均呈逐渐缩短的趋势。试验第3d和4d,RS组和NS干预组大鼠寻找平台的时间明显长于CONT组(P<0.05);CZP干预组大鼠寻找平台的时间明显长于NS干预组(P<0.05);第5d时RS组和NS干预组大鼠寻找平台的时间均显著长于CONT组(P<0.01);CZP干预组大鼠寻找平台时间显著长于NS干预组(P<0.01);FMZ干预组大鼠寻找平台时间与NS干预组相比较无显著性差异(P>0.05)。(2)搜寻策略:CONT组大鼠多采用直线和趋向式策略,而RS组、NS干预组、CZP干预组和FMZ干预组大鼠则多以边缘式和随机式为主。(3)穿越平台次数:RS组和NS干预组大鼠60s内穿越平台次数较CONT组均明显减少(P<0.05);CZP干预组大鼠60s内穿越平台次数较NS干预组均明显减少(P<0.05)。FMZ干预组大鼠60s内穿越平台次数与NS干预组相比较无显著性差异(P>0.05)。
　　3、Western blot检测结果:随着大鼠日龄的增长,五组大鼠海马内GABA(A)受体α1和γ2亚单位的蛋白表达水平均逐渐升高。末次干预后当天(即P15),CZP干预组大鼠GABA(A)受体α1亚单位蛋白表达水平与NS干预组相比较无显著性差异(P>0.05);CZP干预组大鼠GABA(A)受体γ2亚单位蛋白表达水平与NS干预组相比明显减少(P<0.05);FMZ干预组大鼠GABA(A)受体α1和γ2亚单位蛋白表达水平与NS干预组相比均略有升高,但无显著性差异(P>0.05);末次干预后20d(即P35), CZP干预组大鼠GABA(A)受体α1和γ2亚单位蛋白表达水平与NS干预组相比较均明显减少(P<0.05);FMZ干预组GABA(A)受体α1和γ2亚单位蛋白表达水平与NS干预组相比较无显著性差异(P>0.05);末次干预后55d(即P70),CZP干预组大鼠GABA(A)受体α1和γ2亚单位蛋白表达水平与NS干预组相比较均明显减少(P<0.05)。FMZ干预组大鼠GABA(A)受体α1和γ2亚单位蛋白表达水平与NS干预组相比较无显著性差异(P>0.05)。
　　4、RT-PCR检测结果:随着各组大鼠日龄的增长,各组大鼠海马内GABA(A)受体α1和γ2亚单位mRNA的表达水平逐渐升高。末次干预后当天(即P15):CZP干预组大鼠GABA(A)受体α1亚单位mRNA在海马地表达水平与NS干预组相比较明显减少(P<0.01);CZP干预组大鼠GABA(A)受体γ2亚单位mRNA在海马地表达水平与NS干预组相比无显著性差异(P>0.05);FMZ干预组大鼠GABA(A)受体α1和γ2亚单位mRNA在海马的表达水平与NS干预组相比均略有升高,但无显著性差异(P>0.05);末次干预20天(即P35):CZP干预组大鼠GABA(A)受体α1和γ2亚单位mRNA在海马的表达水平与NS干预组相比较明显减少(P<0.05);FMZ干预组大鼠GABA(A)受体α1和γ2亚单位mRNA在海马的表达水平与NS干预组相比较无显著性差异(P>0.05);末次干预后55d(即P70),CZP干预组大鼠GABA(A)受体α1和γ2亚单位mRNA在海马的表达水平与NS干预组相比较明显减少(P<0.05)。FMZ干预组大鼠GABA(A)受体α1和γ2亚单位mRNA在海马的表达水平与NS干预组相比较无显著性差异(P>0.05)。
　　结论:(1)化学致痉剂三氟乙醚可以诱导Waster大鼠反复惊厥,新生期大鼠反复惊厥后给予GABA(A)受体激动剂CZP早期干预,将会对大鼠产生一定程度的脑损害,使大鼠生长发育落后,神经反射延迟,并产生成年期新环境适应能力下降,以及远期学习、记忆能力损害。
　　(2)未成熟大鼠反复惊厥后给予GABA(A)受体激动剂CZP早期干预,短期内即明显影响海马GABA(A)受体α1和γ2亚单位相关基因的转录,且该影响将长期存在,并影响蛋白的表达,这可能对脑发育期神经功能的发育产生长期的影响。
　　(3)未成熟大鼠反复惊厥发作后给予GABA(A)受体激动剂CZP早期干预,将导致其远期神经行为学改变和认知损害,也改变了成年期鼠海马内GABA(A)受体亚单位α1和γ2亚单位的表达,这些亚单位表达的长期改变参与到了成年期大鼠记忆损伤和学习的发生过程里,对脑功能产生远期影响。
　　(4)未成熟鼠反复惊厥发作后给予GABA(A)受体拮抗剂FMZ早期干预,未见明显神经行为学及GABA(A)受体α1和γ2亚单位表达的影响,推测可能与“FMZ拮抗作用的发挥主要体现在已用苯二氮卓类药物的情况下”有关。

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前言

实验流程图

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

三、统计学分析

结果

一、三氟乙醚诱导大鼠惊厥的行为学特点

二、GABA(A)受体调质对新生期大鼠惊厥性脑损伤的神经行为学影响

三、GABA(A) 受体调质对新生期鼠惊厥性脑损伤后海马GABA(A)受体α1和γ2亚单位的表达影响

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间公开发表的论文

中英文对照缩略词表

致谢