MiR-217对乳腺癌上皮细胞甲基化关键基因调控作用的研究

摘要

目的:探讨在人乳腺癌上皮细胞系中,miR-217通过直接作用于DNMT1与EZH23′UTR调控DNMT1及EZH2转录后表达水平,为后期动物实验和临床试验提供实验基础。
　　方法:首先利用实时定量PCR技术,检测 HBL-100、MCF-7和 MDA-MB-231三株人乳腺上皮细胞系中miR-217和EZH2转录后表达水平;利用Western blot技术检测三株细胞系中EZH2蛋白表达水平;筛选用于“过表达、抑制miR-217实验”的细胞。然后利用瞬时转染技术,在低表达miR-217细胞中,转染miR-217模拟物;在高表达miR-217细胞中,转染miR-217抑制物,进行miR-217的过表达、抑制实验。最后,将含有miR-217野生型及突变型识别位点的DNMT1及EZH23′UTR质粒载体,分别转染293T细胞,检测其相对荧光素酶活性的改变。
　　结果:RT-PCR结果显示,与正常乳腺上皮细胞系HBL-100比较,EZH2在乳腺癌上皮细胞系MCF-7和MDA-MB-231中显著高表达(P<0.05);而miR-217显著低表达(P<0.05)。Western blot检测结果显示,EZH2在正常乳腺上皮细胞系HBL-100中低表达,乳腺癌上皮细胞系MCF-7、MDA-MB-231中高表达。三阴性乳腺癌上皮细胞系MDA-MB-231中过表达miR-217,DNMT1和EZH2蛋白表达下降;乳腺上皮细胞系HBL-100中抑制miR-217表达,DNMT1和EZH2蛋白表达增高。293T细胞中检测海肾和荧火虫两种荧光素酶活性,双荧光素酶检测结果显示,DNMT1-UTR-WT的相对荧光素酶活性显著低于 DNMT1-UTR-MUT(P<0.05),具有统计学意义;EZH2-UTR-WT的相对荧光素酶活性显著低于EZH2-UTR-MUT(P<0.05),具有统计学意义。
　　结论:在人乳腺癌上皮细胞系中,miR-217下调DNMT1及EZH2蛋白表达,且通过直接作用于DNMT1、EZH23′UTR下调其表达。

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引言

第一部分 人乳腺癌上皮细胞系中EZH2及miR-217转录后表达水平的检测

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 主要仪器和设备

1.3 实验流程

1.4 引物设计

1.5 细胞培养

1.6 Trizol法提取细胞总RNA

1.7 反转录

1.8 RT-PCR

1.9 三株细胞中EZH2蛋白表达水平的检测

2 结果

2.1 Trizol法提取细胞总RNA

2.2 乳腺上皮细胞中EZH2和miR-217两个基因转录后表达水平

2.3 乳腺上皮细胞系中EZH2蛋白表达水平检测结果

3 讨论

第二部分 乳腺癌上皮细胞系中miR-217过表达和抑制实验

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 主要仪器和设备

1.3 实验流程

1.4 三阴性乳腺癌上皮细胞系MDA-MB-231中miR-217 过表达实验

1.5 乳腺上皮细胞系HBL-100中miR-217 抑制实验

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。数据用x ±s表示，用t检验进行比较，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三阴性乳腺癌上皮细胞系MDA-MB-231中miR-217 过表达实验结果

2.2 乳腺上皮细胞系HBL-100中miR-217 抑制实验结果

3 讨论

第三部分 293T细胞中双荧光素酶检测实验

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 主要仪器和设备

1.3 实验流程

1.4 构建miR-217野生型EZH2 3＇UTR载体(EZH2-UTR-WT)

1.5 构建miR-217野生型DNMT1 3＇UTR载体(DNMT1-UTR-WT)

1.6 构建miR-217突变型EZH2 3＇UTR载体(EZH2-UTR-MUT)

1.7 构建miR-217突变型DNMT1 3＇UTR载体(DNMT1-UTR-MUT)

1.8 构建双荧光素酶psiCHECKTM-2载体 psiCHECKTM-2载体结构示意图见图10。我们要将目标片段插入HSV-TK启动子上游。

2 结果

2.1 野生型EZH2 3ˊUTR(EZH2-UTR-WT)克隆载体的构建及鉴定

2.2 野生型DNMT1 3ˊUTR(DNMT1-UTR-WT)克隆载体的构建及鉴定结果

2.3 EZH2-UTR-MUT 和 DNMT1-UTR-MUT 克隆载体的构建及鉴定

2.4 psiCHECKTM-2双荧光素酶克隆载体的构建及鉴定 将EZH2-UTR-WT/MUT 和DNMT1-UTR-WT/MUT四个片段分别亚克隆于psiCHECKTM-2上。

3 讨论

全文总结

参考文献

综述

中英文缩略词表

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