纳米氧化锌对小鼠黑色素瘤细胞(B16)的毒性和代谢的研究

摘要

纳米氧化锌颗粒(Zinc Oxide nanoparticles,ZnO NPs),是近年来在生产工艺和检测方法上最为成熟的纳米材料之一,它的独特的颜色效应、光催化作用及散射和吸收紫外线的能力,使其成为一种倍受人类青睐的纳米材料,越来越广泛的应用于人们的生产生活当中,因此对于其生物安全性的研究势在必行。然而总结近年来对于纳米材料的安全性评价工作的进展发现,对于人们现今应用较广的ZnO纳米材料的生物安全性研究较少。另一方面,有研究表明ZnO NPs可能进入皮肤,有帮助治疗皮肤疾病,所以我们的研究重点是ZnO NPs对皮肤中的黑素瘤细胞所产生的细胞生物效应,看其是否会对黑素瘤细胞产生不可逆转的损伤,并从细胞凋亡的机理上分析ZnO NPs损伤细胞的机制以及是否对黑素瘤细胞分化产生影响,并从基因水平上分析ZnO NPs影响细胞分化的机制,为评价ZnO NPs在皮肤疾病治疗和化妆品方面的应用提供数据。
　　本研究使用X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)、透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)、电动电位(Zeta potential)对实验中所使用的不同粒径ZnO NPs进行详尽表征,为类似的研究工作提供了一套标准的材料表征方法。以小鼠黑素瘤细胞(B16)为细胞模型,研究了15 nm、30 nm、90 nm ZnO对B16细胞的体外细胞生长和代谢的影响作用及其作用机制。以不加纳米氧化锌和加体相氧化锌的处理结果分别作阴性和阳性对照。结果发现,15 nm、30 nm、90 nm ZnO在2~16μg/ml浓度下与B16细胞共培养作用72 h后,在4μg/ml以下,ZnO NPs并未明显抑制细胞生长,引起细胞死亡。当作用浓度大于8μg/ml时,明显抑制细胞生长。随ZnO NPs浓度的增加,细胞体积变小,细胞间隙变大,粘附性降低,细胞变圆,从培养瓶底脱落死亡。倒置显微镜、电镜切片实验观察以及流式细胞仪检测等实验手段定性和定量研究了ZnO NPs对小鼠黑色素瘤细胞凋亡影响。实验中使用碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞单一染色,并用流式细胞仪检测发现15 nm ZnO作用细胞24 h后,凋亡细胞的数量为11.79％,明显高于正常对照组0.57％。DNA琼脂糖凝胶电泳和彗星实验得到了类似的结果,DNA受损。另外丙二醛(malondi-aldehyde,MDA)含量和活性氧水平检测实验中发现ZnO-NPs的刺激可以使细胞产生大量脂质过氧化物和活性氧,致使细胞产生氧化损伤,导致细胞经历线粒体介导的内源途径凋亡死亡。另一方面,由胞外实验得出结果,ZnO NPs和体相ZnO在细胞外对蘑菇酪氨酸酶的活性和多巴的氧化都没有显著性影响。而ZnO NPs诱导细胞中酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)、酪氨酸相关蛋白1(Tyrosinase-related protein1,TYRP-1)、酪氨酸相关蛋白2(Tyrosinase-related protein2,TYRP-2)的mRNA的表达量升高,导致细胞内酪氨酸酶活性水平增高,最终导致细胞内黑色素生成含量升高。相同浓度下,粒径15 nm ZnO NPs比30 nm、90 nm尺寸的ZnO NPs作用明显。所以推断其作用机制可能是ZnO NPs通过影响酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白的基因表达进而影响酪氨酸酶活性进而影响黑色素生成。所以我们认为15 nm、30 nm、90 nm纳米ZnO在浓度大于8μg/ml可以抑制B16细胞的增殖,增加细胞凋亡,影响了B16黑素瘤细胞的代谢,粒径越小作用越强。

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前言

第一章 综 述

1.1 ZnO NPs的性质和应用

1.2 ZnO NPs与其生物效应之间的关系研究

1.3 ZnO NPs与生物体相互作用机理探讨

1.4 在小鼠B16黑素瘤细胞中研究ZnO NPs的意义

1.5 论文研究的内容

第二章 ZnO NPs的表征

2.1 实验材料和药品

2.2实验仪器

2.3 实验方法

2.4结果分析与讨论

第三章 ZnO NPs的细胞毒性

3.1 实验材料和药品

3.2 实验仪器

3.3 实验方法

3.4 结果分析与讨论

第四章 ZnO NPs对B16细胞的形态的影响

4.1 实验材料和药品

4.2 实验仪器

4.3 实验方法

4.4 结果分析与讨论

第五章 ZnO NPs对B16细胞的抗氧化指标的影响

5.1 实验材料和药品

5.2 实验仪器

5.3 实验方法

5.4 结果分析与讨论

第六章 ZnO NPs对B16细胞的酪氨酸酶活性、黑色素含量和基因表达水平的影响

6.1 实验材料和药品

6.2 实验仪器

6.3 实验方法

6.4 结果分析与讨论

第七章 结论与展望

参考文献

作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文

致谢