鼠抗人B7-H4单克隆抗体的研制及其在乳腺癌B7-H4表达检测中的运用研究

摘要

T细胞活化需要双信号,除了T细胞特异性受体(TCR)识别抗原提呈细胞(APC)表面抗原肽-MHC复合物产生的第一信号外,还需要共刺激分子和其配体或受体结合产生第二信号。B7家族是经典的共刺激分子家族之一,其中B7-H4分子作为一名新成员,其在肿瘤免疫逃逸中的作用越来越受到大家的关注。人B7-H4分子的cDNA长约1.8 Kb,位于染色体1 p11.1,编码282个氨基酸。B7-H4的mRNA广泛表达于淋巴或非淋巴组织,但是B7-H4蛋白在正常组织几乎检测不到,这表明其在转录后水平受到严格的调控。近年来,越来越多的研究发现,B7-H4分子异常表达在各种肿瘤组织,如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌等。临床回顾性病例分析发现, B7-H4的表达与临床病理学特征存在相关性,通过生存分析发现高表达B7-H4的病例预后差,死亡率高,并且在肿瘤患者外周血中也发现了高水平的可溶性B7-H4(sB7-H4)。此外,研究还发现,B7-H4与移植免疫排斥和自身免疫病理相关,转染了B7-H4基因的移植物可以抑制宿主T细胞的活性,从而延长移植物的生存时间。这些研究结果都提示,B7-H4是个重要的负性共刺激分子,具有重要的研究和运用价值。但遗憾的是,自从2003年B7-H4被发现以来已经过去十余年,由于B7-H4受体尚未明确及缺乏抗B7-H4功能性抗体,我们对B7-H4的了解甚少。因此,研制B7-H4功能性单克隆抗体、构建靶向研究工具迫在眉睫。本课题研究旨在通过以B7-H4稳定转染细胞株为免疫原,应用细胞融合技术研制鼠抗人B7-H4单克隆抗体,并对其生物学特性和功能作初步分析;进一步应用该抗体分析68例乳腺癌组织和30例乳腺纤维瘤组织上B7-H4的表达,结合临床病理资料分析其临床意义。本课题拟为进一步探究B7-H4生物学特性和信号机制提供有价值的手段,并为临床诊断、预后评估和靶向治疗开拓新的途径。本研究分为两个部分：
　　第一部分：鼠抗人B7-H4分子抗体的研制及生物学特性研究。
　　目的：研制鼠抗人B7-H4单克隆抗体,并分析其生物学特性和功能。
　　方法：⑴复苏本所构建的B7-H4基因转染细胞株293T/B7-H4,从mRNA水平和膜分子表达水平进行验证；⑵以验证准确、稳定、高表达B7-H4的转基因细胞293T/B7-H4为免疫原,辅以佐剂,经颈背部皮下多点和腹腔免疫BALB/c小鼠。三次常规免疫和一次加强免疫后,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合;经选择性培养基HAT培养后,以293T/B7-H4为阳性筛选细胞株,以转染空载体的293T/Mock为阴性对照细胞株,经过流式细胞术反复筛选和多次克隆化培养后,获得了持续、稳定分泌鼠抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株；⑶采用Ig亚型快速定性试纸法、Western blot、免疫细胞化学法、竞争结合抑制实验和细胞核染色体计数等试验,对获得的单克隆抗体及杂交瘤细胞株进行生物学特性的鉴定;利用获得的单克隆抗体分析了肿瘤细胞株上B7-H4的表达；⑷通过CCK8细胞增殖实验检测该单克隆抗体对B7-H4信号抑制T细胞增殖的阻断效应。
　　结果：①复苏后的293T/B7-H4转基因细胞生长状态良好,RT-PCR显示在mRNA水平能扩增出特异性条带,流式细胞术显示膜表面高表达B7-H4分子；②成功获得一株稳定、特异性分泌鼠抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2B7。经体外连续培养半年以上,液氮冻存后复苏,细胞生长状态良好,分泌抗体性能稳定；③细胞核型分析显示,杂交瘤细胞株的染色体在100条以上,大于小鼠B细胞和Ag8细胞的染色体数目,表明为两者融合体;Ig亚型快速定性试纸条分析显示,单抗2B7重链为IgG1,轻链为κ链亚型;流式细胞术、免疫细胞化学法结果显示单抗2B7能特异性结合293T/B7-H4基因转染细胞株表面B7-H4分子;Western-blot分析显示,单抗2B7能分别与基因转染细胞株293T/B7-H4蛋白裂解液和商品化B7-H4/人Fc融合蛋白特异性结合,形成大小约为40~50 KD的特异性条带,与B7-H4蛋白大小一致;采用本室建立的腹水诱生法制备单克隆抗体,腹水形成阳性率约为95％,腹水的产量平均为4ml/只小鼠,经Protein G亲和层析柱分离纯化抗体,单克隆抗体纯化后蛋白含量为1~2mg/ml,其效价为1:1000以上;单抗识别位点竞争实验结果表明2B7与商品化单抗MIH43识别表位不同;利用单抗2B7检测到肿瘤细胞株表面不同程度B7-H4的表达；④向B7-H4融合蛋白与T细胞体外联合培养体系中加入单抗2B7,CCK8增殖试验结果显示,单抗2B7能有效阻断B7-H4分子对T细胞增殖的抑制效应。
　　结论：成功获得了1株稳定分泌特异性鼠抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体和商品化单抗MIH43识别不同的抗原表位,能运用于流式、免疫组化和免疫印迹分析。此外,该单抗能有效阻断B7-H4的负向信号,初步表明其具有阻断功能的生物学特性,为进一步探讨B7-H4潜在的信号通路奠定良好的物质基础。
　　第二部分：鼠抗人B7-H4单克隆抗体2B7在乳腺癌B7-H4表达检测中的运用研究。
　　目的：利用研制的鼠抗人B7-H4单克隆抗体2B7,以乳腺纤维瘤组织为对照,分析乳腺癌组织中B7-H4的表达及其临床意义。
　　方法：通过免疫组织化学技术分析乳腺癌组织68例,良性纤维瘤30例中B7-H4的表达情况,并结合临床资料统计分析B7-H4的表达与乳腺癌患者临床特征之间的关系。
　　结果：免疫组织化学结果显示,乳腺癌组织中B7-H4的阳性率为75％,明显高于纤维瘤组织(17％)(P<0.05),并与雌激素受体(ER)、人类表皮生长因子2(Her-2)的表达存在相关性。
　　结论：利用研制的鼠抗人B7-H4单克隆抗体2B7分析乳腺癌组织中B7-H4的表达,发现癌组织呈异常表达,与乳腺组织良性病变存在差异(P<0.05),并且与ER的表达呈负相关,与Her-2的表达呈正相关,而与年龄、肿瘤大小、病理类型等其他变量之间不存在显著差异,提示了B7-H4分子的检测可能为乳腺癌的临床诊断和判断预后提供新的生物学标志。综上所述,本课题成功研制出1株能稳定分泌鼠抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B7,所得单克隆抗体特异性强、效价高,可用于流式细胞术、Western blot、免疫组织化学等多种检测,并能阻断B7-H4介导的负性信号。利用单克隆抗体2B7检测人类乳腺癌组织中B7-H4的表达,并通过统计学分析了B7-H4的表达与临床资料的相关性,为进一步研究人B7-H4分子的生物学特性及其在肿瘤中的作用机制奠定坚实的物质基础。

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研究背景

参考文献

第一部分 鼠抗人B7-H4单克隆抗体的制备和生物学功能的鉴定

1 试剂与材料

2.实验方法

3 结果

4.讨论

参考文献

第二部分 鼠抗人B7-H4单抗2B7对乳腺癌组织B7-H4表达检测中的运用研究

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

参考文献

小结与展望

硕士学位学习期间发表的论文

本课题的受资助情况

缩写词表

致谢