免疫激活骨髓间充质干细胞的旁分泌对成骨细胞功能的影响

摘要

第一部分骨髓间充质干细胞的分离、鉴定及旁分泌功能检测
　　目的:骨髓间充质干细胞(Marrow mesenchymal stem cells, MSCs)具有向成骨细胞、成软骨细胞、心肌细胞、成脂肪细胞等多谱系分化潜能。随着研究的深入,MSCs的旁分泌作用及免疫抑制活性逐渐引起广泛关注。在本研究中,我们首先使用 IFN-γ和TNF-α联合刺激 MSCs,然后通过检测MSCs条件培养基(MSC-CM)的生物活性因子的变化水平,来研究其旁分泌功能变化。
　　方法:
　　(1)收集无其他合并症的骨折患者骨髓,采用密度梯度离心法收集含有MSCs的低密度层,获取原代MSCs,采用流式细胞术进行细胞鉴定。
　　(2)取第三代 MSCs,在特定诱导剂的诱导下定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞,并通过特异性染色进行鉴定。
　　(3)用炎症因子IFN-γ和TNF-α免疫激活干细胞,制备BM-MSCs条件培养基(MSC-CM)。
　　(4)ELISA及CBA法分析BM-MSCs条件培养基(MSC-CM),检测HGF, VEGF和TGF-β含量及IL-2,IL-4,IL-6和 IL-10含量变化。
　　结果:
　　(1)我们收集了8例无其他合并症的骨折患者骨髓,均培养出原代MSCs细胞,细胞原代培养时排列呈螺旋状或漩涡状。传代培养后,细胞基本保持长梭形的形态。流式细胞术检测到细胞表达CD44、CD73、CD90而不表达CD34。
　　(2)通过茜素红染色、油红O染色、阿尔新蓝染色分别检测BM-MSCs成骨、成脂、成软骨分化能力,我们观察到茜素红染色的钙结节,油红 O染色的脂肪小滴,阿而新蓝染成蓝色的硫酸多聚糖。
　　(3)联合使用炎症因子IFN-γ和TNF-α预刺激BM-MSCs,条件培养基中IL-6, VEGF, HGF和TGF-β的含量显著升高(p<0.01),但IL-2, IL-4和 IL-10的含量没有显著变化(p>0.05)。
　　结论:
　　(1)骨髓间充质干细胞生长旺盛,传代以后纯化度可达90％以上,传至10代以上仍能保持固定的长梭形细胞形态。
　　(2)BM-MSCs具有很强的多向分化特性,可作为细胞工程中理想的种子细胞。
　　(3)IFN-γ和 TNF-α预刺激干细胞后,BM-MSCs的旁分泌功能发生了显著的变化,其分泌IL-6、VEGF、HGF和TGF-β的作用显著加强。
　　第二部分免疫激活后BM-MSCs对成骨细胞功能的影响
　　目的:高能量损伤所致的难治性骨不连、骨缺损发生率较高,目前在治疗上仍有较大的困难。骨折不愈合与骨断端的成骨细胞数量和活性降低有关。我们前期的研究显示,炎症因子IFN-γ和TNF-α免疫激活MSCs后,其旁分泌功能发生了显著的变化,其中IL-6、 VEGF、 HGF和TGF-β的分泌量明显升高。在本研究中,我们用MSC条件培养基孵育成骨细胞来探索免疫激活后BM-MSCs的旁分泌对成骨细胞增殖、迁徙、分化及细胞骨架的影响
　　方法:用IFN-γ和TNF-α预刺激MSCs,制备MSC条件培养基(MSC-CM)培养成骨细胞(MG63)。CCK8法检测MG63细胞增殖能力;细胞划痕法检测MG63细胞迁徙能力;鬼笔环肽染色法检测MG63细胞骨架;Real-time PCR法检测ALP、COLI及OCN基因的表达量变化;免疫荧光法检测OPN表达;茜素红染色检测其矿化能力。
　　结果:在IFN-γ和TNF-α联合刺激的MSC条件培养基作用下,MG63细胞的增殖速度明显加快;细胞划痕结果示其迁徙能力显著提高(p<0.01);诱导第4、7天后成骨细胞分化标志基因表达量明显增多(p<0.05);免疫荧光染色示联合刺激组的OPN阳性细胞数明显升高;茜素红染色示 IFN-γ+TNF-α组的MSC-CM诱导MG63细胞21天后钙结节形成更多,矿化沉积作用更强;鬼笔环肽染色显示细胞骨架未受影响。
　　结论:经免疫激活后的MSC的旁分泌作用可以显著促进成骨细胞的增殖、迁徙、分化和矿化能力,从多个阶段加强成骨细胞的成骨能力,为临床应用MSC治疗骨质缺损指导了新方向。

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引言

1．骨髓间充质干细胞概述

2．BM-MSCs的旁分泌功能

3．BM-MSCs的免疫抑制活性

4．BM-MSCs与骨不连、骨缺损

5. 成骨细胞的生物学功能

6．免疫活化的BM-MSCs旁分泌与成骨效应

第一部分 骨髓间充质干细胞的分离、鉴定及旁分泌功能检测

前言

材料和方法

1．主要试剂与材料

2．主要仪器

3．研究方法

结果

1．人BM-MSCs的原代培养与形态学观察

2．人BM-MSCs 的免疫表型分析

3．BM-MSCs成骨、成软骨及成脂诱导后特异性染色鉴定

4．IFN-γ/TNF-α预刺激BM-MSCs 的旁分泌变化

讨论

参考文献

第二部分 免疫激活BM-MSCs的旁分泌对成骨细胞功能的影响

前言

材料与方法

1．主要试剂

2．主要实验仪器

3．实验分组

4．细胞增殖实验（CCK-8）

5．细胞迁移实验（划痕试验）

6．细胞骨架实验（鬼笔环肽染色）

7. 逆转录PCR（RT-PCR）

8．实时定量PCR（qRT-PCR）

9. 免疫荧光法检测骨桥蛋白（OPN）

10. 钙结节茜素红染色

11. 数据统计分析

结果

1．MG63成骨样细胞增殖检测

2．MG63成骨样细胞迁徙检测

3．MG63成骨样细胞骨架观察

4．MG63成骨样细胞分化检测

5. OPN蛋白表达荧光检测

6. MG63成骨样细胞矿化沉积作用检测

讨论

参考文献

结论

综述

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