重组腺病毒介导的人ING4基因对胃癌多药耐药细胞株SGC7901/CDDP耐药逆转机制的体内外实验研究

摘要

目的:1.建立顺铂耐药型胃癌细胞株SGC7901/CDDP(2ug/ml),为研究胃癌化疗多药耐药提供细胞基础;2.体内外实验研究重组腺病毒介导的人ING4(inhibitor of growth4,生长抑制因子4)基因表达对胃癌多药耐药细胞株SGC7901/CDDP的耐药逆转效果和潜在分子机制。
　　方法和结果:
　　一、顺铂耐药型胃癌细胞株SGC7901/CDDP(2ug/ml)的建立和其多药耐药特性的鉴定
　　应用逐步增加培养基中顺铂(Cisplatin, CDDP)浓度(从0.05ug/ml至2ug/ml)持续作用的方法诱导亲本敏感胃癌细胞株SGC7901对化疗药物产生多药耐药,培养顺铂耐药型胃癌细胞株SGC7901/CDDP(2ug/ml)。采用CCK-8法测定ADM、5-FU和CDDP对SGC7901/CDDP和 SGC7901细胞的半数抑制浓度(50％inhibiting concentration, IC50),确定SGC7901/CDDP的多药耐药特性。荧光定量PCR法鉴定SGC7901/CDDP细胞和SGC7901细胞的多药耐药和细胞凋亡相关基因的表达情况。结果发现:通过逐步持续增加顺铂浓度半年,我们成功培养出顺铂耐药型胃癌细胞株。相对于敏感株SGC7901,其对CDDP、5-FU和ADM的耐药倍数分别为19.92、7.53和6.68。荧光定量PCR结果显示:SGC7901/CDDP较SGC7901细胞MDR1、MRP1、Bcl-2和Survivin基因表达升高,而Bax基因表达明显降低。
　　二、重组腺病毒介导的人ING4基因表达对胃癌多药耐药细胞株SGC7901/CDDP的耐药逆转机制的体内外实验研究
　　用本实验室已保存的高纯度、高效价的带有ING4基因的复制缺陷型腺病毒Ad-ING4(100MOI)及空病毒 Ad-GFP(100MOI)感染胃癌多药耐药细胞SGC7901/CDDP,RT-PCR和Western blot法鉴定ING4基因和蛋白在SGC7901/CDDP细胞中表达情况。为进一步研究Ad-ING4对SGC7901/CDDP细胞的多药耐药逆转效果和可能机制,体外细胞实验部分用CCK-8法进一步测定ADM、5-FU和CDDP对过表达ING4的SGC7901/CDDP细胞的半数抑制浓度(IC50)的变化以及荧光定量PCR法测定多药耐药相关基因MDR1、MRP1和细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2和Survivin的表达变化情况。体内动物实验部分建立SGC7901/CDDP细胞裸鼠人胃癌移植瘤模型,观察Ad-ING4介导的ING4表达在体内对裸鼠人胃癌移植瘤的耐药逆转作用。免疫组化法检测多药耐药和细胞凋亡相关蛋白P-gp、MRP1、Bax、Bcl-2和Survivin的表达。上述实验结果显示:ING4基因和蛋白在SGC7901/CDDP细胞中成功表达, CCK-8法显示CDDP、5-FU和ADM对过表达ING4的SGC7901/CDDP细胞的IC50明显减低,耐药逆转倍数分别为9.86、4.09和2.23;荧光定量PCR显示过表达ING4后SGC7901/CDDP细胞MDR1、MRP1、Bcl-2和Survivin基因表达显著降低,而Bax基因表达明显升高;体内实验结果表明:Ad-ING4治疗后移植瘤生长明显受到抑制,具有明显的抑瘤增敏效应,进一步免疫组化显示Ad-ING4能明显降低P-gp、MRP1、Bcl-2、Survivin蛋白的表达和升高Bax蛋白的表达。
　　结论:
　　1.通过体外连续诱导胃癌亲本细胞SGC7901成功获得2ug/ml的顺铂耐药型胃癌细胞株SGC7901/CDDP,并进一步鉴定得出其具有多药耐药特性。
　　2. SGC7901/CDDP细胞的多药耐药形成机制为上调ABC转运体和抑制凋亡途径。
　　3. Ad-ING4表达联合顺铂体内能抑制SGC7901/CDDP裸鼠人胃癌移植瘤生长,具有协同抑瘤增敏效应。
　　4. Ad-ING4逆转胃癌SGC7901/CDDP细胞化疗多药耐药是通过下调ABC转运体和激活凋亡途径而实现的。

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一 实验材料

二 实验方法

结果

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结论

参考文献

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