干细胞移植诱导产生调节性T细胞在同种异体心脏移植中的作用

摘要

第一部分:大鼠骨髓间充质干细胞纳米铁颗粒标记
　　目的:以超顺磁氧化铁纳米颗粒标记大鼠骨髓间充质干细胞，检测纳米铁标记对骨髓间充质干细胞功能的影响。
　　方法:取200-250gWistar大鼠，分离股骨和胫骨的骨髓后，以贴壁分离法获取大鼠骨髓间充质干细胞，并传代培养，显微镜下观察生长。取第三代骨髓间充质干细胞，以流式细胞仪分别检测细胞表面CD14、CD29、CD31、CD34、CD45、CD90分子表达情况。以超顺磁氧化铁纳米颗粒溶液(SPIO25ug/ml，PLL0.75ug/ml)标记间充质干细胞，光镜下观察细胞生长情况，透射电镜观察细胞标记状况。并将钠米铁颗粒标记前后的间充质干细胞分别进行成骨和成脂肪诱导分化，观察纳米铁标记对干细胞分化功能的影响情况。
　　结果:贴壁分离培养法可以顺利分离并纯化大鼠骨髓间充质干细胞，细胞生长良好，表面分子CD29、CD90呈阳性表达，不表达CD14、CD31、CD34、CD45，符合骨髓间充质干细胞特征。纳米铁标记后细胞生长良好，电镜下见细胞形态无变化，胞浆内可见SPIO颗粒。标记前后间充质干细胞均具有良好成骨和成脂肪分化功能。
　　结论:含25ug/mlSPIO，0.75/mlPLL的超顺磁氧化铁标记溶液可良好标记大鼠骨髓间充质干细胞，对干细胞表面分子表达及成骨、成脂肪等基本生物学功能无明显影响。
　　第二部分:大鼠骨髓间充质干细胞对T细胞功能影响的体外实验研究
　　第一节骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖能力影响研究
　　目的:通过体外混合淋巴细胞反应，检测大鼠骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖能力的影响。
　　方法:以SD大鼠T淋巴细胞5×104个为反应细胞，Wistar大鼠T淋巴细胞5×104个为刺激细胞，建立单向混合淋巴细胞反应，反应中另分别加入不同量Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。分组:A组:SD大鼠T淋巴细胞单独培养;B组:SD大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠T淋巴细胞;C组:SD大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠MSC细胞5×102个;D组:SD大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠MSC细胞5×103个;E组:SD大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠MSC细胞5×104个。混合细胞反应72h后，H3掺入法检测各组细胞增殖情况，
　　结果:混合淋巴细胞反应后，B、C、D、E各实验组T细胞明显增殖，与A组有显著统计学差异，加入干细胞的C、D、E各组T细胞增殖能力逐渐下降，组间有显著差异。
　　结论:大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以抑制反应性T淋巴细胞的增殖，这种抑制作用具有干细胞数量依赖性。
　　第二节骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞亚群的影响研究
　　目的:通过体外混合细胞培养，检测大鼠骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞亚群的影响。
　　方法:同第一节分组方法建立体外混合细胞培养体系，细胞培养72h后，流式细胞仪检测各组CD4+CD25+T细胞比例，并计算各组CD4+/CD8+T细胞比值。ELISA法检测各组培养上清液中IL-2，IL-4，IL-10，TGF-β1，IFN-γ水平。
　　结果:混合细胞反应后，加入干细胞的C、D、E各组，CD4+CD25+T细胞比例及CD4+/CD8+T细胞比值逐渐增加，C、D、E各组有统计学差异。B、C、D、E各组IL-2和IFN-γ水平逐渐下降，IL-4、IL-10、TGF-β1水平逐渐升高，各组间有统计学差异。
　　结论:大鼠骨髓间充质干细胞在体外淋巴细胞混合培养中，可以提高CD4+CD25+调节性T细胞比例，及CD4+/CD8+细胞比值，这种作用具有剂量依赖性，与提高TGF-β1、IL-4、IL-10水平，降低IL-2、IFN-γ水平，促进Th细胞分化向Th2方向偏移等因素有关。
　　第三部分骨髓间充质干细胞静脉输注联合胸腺注射诱导同种移植免疫耐受的实验研究
　　目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞移植预处理方法诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的作用，并探讨分子机制。
　　方法:建立雄性Wistar大鼠至雌性SD大鼠同种异体腹腔异位心脏移植模型。在心脏移植前1周，分别取纳米铁标记的供体Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，进行受体SD大鼠的胸腺内注射和尾静脉注射。实验分组:A组（对照组）:仅行Wistar大鼠至SD大鼠腹腔同种异位心脏移植;B组（静脉注射组）:受体（SD大鼠）经颈静脉注射供体（Wistar大鼠）MSCs1×106/0.2ml，一周后行Wistar大鼠至SD大鼠腹腔同种异位心脏移植;C组（胸腺注射组）:受体（SD大鼠）胸腺内注射供体（Wistar大鼠）MSCs5×105/0.1ml，余同B组;D组（静脉注射+胸腺注射组）:受体（SD大鼠）经颈静脉注射供体（Wistar大鼠）MSCs1×106/0.2ml，余同C组。触诊法观察心脏移植物存活时间。移植后第1、3、5天分别取心脏移植物分离淋巴细胞，提取RNA，相对定量RT-PCR检测各组IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、miR-7a、miR-155、miR-182、miR-183、miR-434-3p水平。分别取外周血，以流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞比例。PCR检测受体内供体SRY基因表达情况。MRI和普鲁士蓝染色检测标记干细胞在移植后的分布状况。
　　结果:大鼠同种异体心脏移植后，B、C、D组移植物存活时间较对照组明显延长，有统计学差异。CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞比例逐步提高，第5天明显，有统计学差异。移植后第1、3、5天miR-7a、miR-182、miR-183水平逐步升高，miR-434-3p水平逐步降低，各时间点有统计学差异，但同一时间点各组差异不明显。第3天和第5天B、C、D组miR-155水平增幅下降，与对照组相比有统计学差异，D组有显著差异。移植后第5天，IL-2、IFN-γ水平明显下降，与对照组相比，B组有统计学差异，C、D组有显著差异;C、D组IL-4水平升高，有统计学差异;D组IL-10水平升高，有显著性差异。B、C组受体大鼠腹腔淋巴结均可见供体SRY基因表达。MRI和普鲁士蓝染色可见胸腺及移植心脏内标记干细胞存留，数量逐渐减少。
　　结论:大鼠同种心脏移植后，受体miR-155，miR-182，miR-183和miR-7表达升高，miR-434-3p表达下降。胸腺内注射供体MSCs和静脉内注射供体MSCs可以增加受体内CD4+CD25+调节性T细胞数量，降低受体大鼠miR-155表达水平，提高移植物细胞因子IL-4，IL-10表达水平，降低IL-2、IFN-γ表达水平，并促进供受体嵌合，延长心脏移植物存活时间。胸腺注射和静脉注射相结合效果更好。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞纳米铁颗粒标记

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

小结

参考文献

第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞对T细胞功能影响的体外实验研究

第一节 骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖能力影响研究

第二节 骨髓间充质千细胞对T淋巴细胞亚群的影响研究

讨论

小结

参考文献

第三部分 骨髓间充质干细胞静脉输注联合胸腺注射诱导同种移植免疫耐受的实验研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

小结

参考文献

结论

综述一 调节性T细胞研究进展

综述二 microRNA研究进展

缩略词表

攻读学位期间发表论文和科研情况

致谢