局部低剂量X线辐照对BMSCs向周围神经损伤部位归巢影响的实验研究

摘要

第一部分：大鼠BMSCs的分离、培养、鉴定及染色
　　目的：掌握骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及染色的方法，并对其生物学特性进行初步分析。
　　方法：大鼠处死消毒后，无菌操作取出大鼠双侧股骨、胫骨，暴露骨髓腔，用L-DMEM反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，离心，弃上清，重悬后计数，接种于的细胞培养瓶内，置于37℃、饱和湿度、5％C02条件下培养，应用全骨髓培养结合差速贴壁法进行细胞分离纯化。待细胞达85%-90%融合时，胰酶消化传代，倒置相差显微镜下观察各代细胞的生长及形态变化。应用流式细胞仪对细胞表面标识进行鉴定。细胞计数法观察并测绘细胞生长曲线图。使用CFDA SE染料对细胞进行染色标记。
　　结果：原代细胞接种培养后2h后，可观察到部分细胞开始贴壁，多呈圆形，折光性较强。1天后可见贴壁细胞增多，常呈圆形、椭圆形，少量梭形。3天后贴壁细胞逐渐呈长梭形、三角或多边形，多形成5-10个细胞的簇状细胞团。2-4天后细胞呈克隆样生长，增殖缓慢，细胞形态逐渐趋于梭形、长梭形，也有少量圆形细胞及多角形细胞。第5-8天时细胞克隆样生长快速，簇状细胞集落迅速增多，并向周围不断扩大。原代培养第10-14天细胞集落可达85%-90%融合，通常表现为鱼群状、旋涡状，即可传代。P2、P4、P6代细胞的生长增殖曲线相接近。取生长状态均一良好的P4代BMSCs，应用流式细胞法进行 BMSCs表面抗原标志物鉴定结果为：CD34(0.8%)、CD45(1.3%)阴性；CD29（93.7%）、CD90(99.8%)阳性。
　　结论：应用全骨髓培养结合差速贴壁法能在体外简单、快速的分离和纯化大鼠BMSCs，且增殖迅速、性状稳定。
　　第二部分局部低剂量X线辐照对BMSCs向周围神经损伤部位归巢影响的实验研究
　　目的：设计在小间隙吻合法修复周围神经损伤的基础上，结合局部低剂量 X线辐照，通过大鼠尾静脉移植BMSCs，观察低剂量X线辐照对BMSCs向周围神经损伤部位归巢的影响，并探讨其可能的机制。
　　方法：采用健康清洁级2月龄雄性SD大鼠60只，体重250-300g，经小间隙吻合法制成周围神经损伤修复模型后，随机均分为2组，实验组于术后24h行局部1 Gy的X辐照，对照组不予以照射；低剂量辐照干预后1小时，两组大鼠均经尾静脉移植BMSCs。分别于BMSCs移植后24h、48h、96h每组每个时间点各选取6只大鼠，制作冰冻切片，荧光显微镜观察比较两组的BMSCs归巢差异。并通过大鼠一般状态、光镜下神经大体形态、坐骨神经指数、运动神经传导速度、组织学和免疫组织化学、神经透射电镜的超微结构观察比较两组大鼠神经功能的恢复情况。
　　结果：
　　1、各时段大鼠坐骨神经冰冻切片后荧光显微镜下对比观察BMSCs归巢数结果：实验组：24h(+++)；48h(++)；96h（++）。对照组：24h(++)；48h(+)；96h(-)。低剂量X线辐照干预后的实验组的BMSCs归巢数明显多于对照组，且表现为细胞移植后24h归巢数最多，随后下降。
　　2、大体观察：（1）两组大鼠均在术后出现患肢瘫痪，各足趾并拢，不能主动展开，踝及足趾下垂致使足背或趾尖触地拖行。实验组大鼠术后均未出现足部溃疡及自噬现象。而对照组大鼠术后2周有4只出现足跟部溃疡，至第4周溃疡完全愈合，无肢体自噬现象。（2）患肢自主活动恢复情况：实验组术后3周开始患肢自主活动，对照组术后5周开始恢复自主活动。
　　3、显微镜下神经吻合口形态观察：实验组中神经损伤处与周围组织粘连明显轻于对照组，且直径与正常神经干无明显差异；而对照组神经直径较正常神经干稍细，且吻合口处表面可见的新生毛细血管明显少于实验组。
　　4、坐骨神经功能指数（SFI）：两组大鼠SFI都表现为逐渐恢复，术后4周、8周、12周各时间段实验组SFI恢复均优于对照组，差异有明显统计学意义（p<0.05）。
　　5、组织学和免疫组织化学观察：（1） HE染色：实验组和对照组均可见神经纤维通过小间隙到达远端。实验组神经纤维排列、单位面积再生神经纤维密度、轴突肿胀程度等情况均优于对照组。（2）免疫组织化学：实验组抗S-100（+++），对照组抗S-100（++）。实验组雪旺氏细胞增生明显，雪旺氏细胞数目较多。而对照组相对较少。
　　6、神经电生理检测：两组大鼠坐骨神经传导速度都有不同程度的恢复，实验组在6周、12周时坐骨神经传导速度及波幅均高于对照组，差异有明显统计学意义（p<0.05）。
　　7、透射电镜观察：每高倍显微镜视野下实验组神经纤维数量、轴突直径、髓鞘形态、神经纤维形态结构均优于对照组。
　　结论：通过尾静脉移植的BMSCs能够归巢至周围神经损伤部位；同时，通过局部低剂量X线辐照干预可明显促进BMSCs向周围神经损伤部位归巢，从而起到促进神经的再生和功能的恢复，但其明确机制还有待进一步研究探讨。

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第一部分：大鼠BMSCs的分离、培养、鉴定及染色

引言

第一章 材料与方法

第二章 结 果

第三章 讨 论

第四章 结 论

参考文献

附图

第二部分：局部低剂量X线辐照对BMSCs向周围神经损伤部位归巢影响的实验研究

引言

第一章 材料与方法

第二章 结 果

第三章 讨 论

第四章 结 论

参考文献

附图

综述:间充质干细胞归巢在周围神经损伤修复中的应用及研究进展

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