孕期咖啡因暴露诱导子代血管平滑肌功能改变的离子通道机制研究

摘要

大量研究表明不良刺激可增加子代罹患心血管疾病的风险。咖啡、茶、可乐等含相当量咖啡因，咖啡因可通过直接影响肌细胞的收缩性而影响心血管功能。随着含咖啡因食品的普及，孕期咖啡因暴露对子代心血管的影响虽日益受到关注，但相关研究很少，多为在体水平，针对胎儿或者新生儿的血流动力学指标进行监测，极少有研究涉及子代出生后至成年过程中的心血管发育的“程序化调控”，尤其涉及离子通道机制的研究未见报导。
　　本课题重点运用膜片钳技术，激光共聚焦，同步动态监测微动脉直径和血管细胞内钙离子实时变化技术，结合分子生物学检测探讨孕期咖啡因暴露可能诱导子代血管平滑肌细胞中与膜电位调节相关的钙信号及其与下游大电导钙依赖性钾通道（Large conductance Ca2+ dependent-K+-channels, BKCa）偶联的异常，致膜电位失衡，血管张力增加。
　　第一部分孕期咖啡因暴露对胎鼠发育及成年子代体重的影响
　　目的：研究孕期咖啡因暴露对胎鼠发育及成年子代大鼠体重的影响。
　　方法：实验组孕鼠从妊娠第3.5天到第19.5天给予咖啡因皮下注射（20mg/kg, twice a day）。对照组给予生理盐水注射。在孕第20.5天剖腹产取胎鼠，称量胎鼠体重、体长和尾长。自然分娩后，在哺乳期内实验组与对照组给予正常饮食，幼鼠母乳喂养。断奶后，子代大鼠给予正常饮食直至5月龄用于实验。随机抽取部分子代成年大鼠，测体重。
　　结果：
　　1）孕期咖啡因暴露组胎鼠的体长、尾长、体重明显低于对照组胎鼠；孕期咖啡因暴露导致胎鼠宫内生长受限（IUGR）发生率显著增加；
　　2）子代成年大鼠体重各组间无显著差异。
　　结论：孕期咖啡因暴露导致胎鼠宫内生长受限，经过追赶性生长，子代成年大鼠（雄性）的体重差异消失。
　　第二部分孕期咖啡因暴露对子代血压，肠系膜动脉收缩功能及血管平滑肌细胞膜电位的影响
　　目的：研究孕期母体咖啡因暴露对子代大鼠血压、心率等心血管功能指标和离体肠系膜动脉张力的影响，并在细胞水平初步指出子代血管张力的变化与平滑肌细胞膜电位调节异常相关。
　　方法：子代大鼠行股动、静脉插管术，以PowerLab生理记录仪在体动态监测动物清醒无应激条件下的血压、心率等指标。部分子代分离肠系膜动脉后，制备血管环，以PowerLab生理记录仪检测血管张力情况。分离单个肠系膜动脉平滑肌细胞，以膜片钳技术记录细胞膜电位。
　　结果：
　　1）孕期咖啡因暴露诱导成年子代升压反应异常，基础状态下两组子代收缩压、舒张压、平均动脉压和心率等心血管指标无明显差异；在血管收缩物质如去氧肾上腺素（PE）刺激下，孕期咖啡因组子代的升压反应较正常对照组子代明显；
　　2）孕期咖啡因暴露诱导成年子代阻力血管张力增大，对PE的收缩反应较对照组明显。在PE作用下咖啡因组子代肠系膜动脉的最大收缩及pD2都较对照组明显增大。两组内皮功能未见明显损伤；
　　3）孕期咖啡因组子代肠系膜动脉平滑肌细胞膜电位调节出现异常。虽然静息状态下，两组膜电位未见明显差异，但PE作用下，孕期咖啡因组子代细胞膜电位去极化异常，膜电位较对照组明显升高。
　　结论：血管收缩剂PE引发的异常升压反应可能与阻力血管张力增大，平滑肌细胞收缩增强有关
　　第三部分孕期咖啡因暴露对子代平滑肌细胞膜电位调节相关的细胞钙信号的影响
　　目标：研究孕期母体咖啡因暴露对子代平滑肌细胞膜电位调节相关钙信号的影响。
　　方法：电压门控性钙通道电流以Ba2+作载体，并在电极内液中加Cs+及细胞外液中加TEA-Cl阻断钾电流，采用传统全细胞电压钳模式来记录全细胞钙电流。以荧光钙成像实时同步检测血管细胞内钙与血管直径变化，观察ryanodine阻断对胞内钙释放和血管收缩反应的影响。用Western blot法对比两组LTCCsα1C亚基的表达，用RT-PCR和 ELISA技术检测两组 RyRs亚型的表达，荧光显微镜下观察 caffeine对ryanodine敏感的钙库的耗竭作用。
　　结果：L型钙通道电流密度在孕期咖啡因组显著下降；孕期咖啡因组子代肠系膜动脉L型钙通道α1C亚基的蛋白表达水平显著低于对照组；孕期咖啡因暴露可诱导胞ryanodine敏感的内钙释放功能降低。
　　结论：L型钙通道功能下降致胞外钙内流效果减弱，但是孕期咖啡因暴露可诱导胞ryanodine敏感的内钙释放功能降低，此作用可能进一步诱导了胞内钙释放偶联的下游BKCa通道的调节减弱，致使膜电位去极化增强
　　第四部分孕期咖啡因暴露对子代肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道电流的影响
　　目的：研究孕期咖啡因暴露对子代肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道电流的影响
　　方法：运用膜片钳单通道技术检测子代肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道生物物理特性的变化。运用穿孔膜片钳技术检测各组BKCa通道瞬时外向钾电流的变化。运用传统全细胞模式记录BKCa通道全细胞电流。运用Western blot技术检测两组BKCa通道α亚基和β1亚基蛋白表达水平。
　　结果：
　　1）孕期咖啡因暴露诱导子代肠系膜动脉平滑肌全细胞钾电流密度降低，BKCa通道电流密度降低；
　　2）孕期咖啡因暴露诱导子代肠系膜动脉平滑肌细胞瞬时外向钾电流（STOCs）活性下降；
　　3）孕期咖啡因刺激诱导BKCa通道生物物理特性异常：BKCa通道电压敏感性，Ca2+敏感性下降；动力学特征改变，表现为开放时间缩短，关闭时间延长；
　　5）孕期咖啡因暴露对子代肠系膜动脉BKCa通道α亚基蛋白表达无明显影响，β1亚基蛋白表达下调。
　　结论：孕期母体咖啡因暴露通过改变子代平滑肌细胞BKCa通道β1亚基的蛋白表达，降低了通道的钙敏感性，导致STOCs活性降低，通道负反馈调节膜电位的作用下降。

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前言

参考文献

第一部分 孕期咖啡因暴露对胎鼠发育及成年子代体重的影响

一、材料与方法

二． 实验结果

三．小结

第二部分 孕期咖啡因暴露对子代血压，肠系膜动脉舒缩功能及血管平滑肌细胞膜电位的影响

第一节 孕期咖啡因暴露对子代血压反应的影响

第二节 孕期咖啡因暴露对成年子代肠系膜动脉血管张力的影响

第三节 孕期咖啡因暴露对成年子代肠系膜动脉平滑肌细胞膜电位的影响

第三部分 孕期咖啡因暴露对子代膜电位调节相关的细胞钙信号的影响

第一节 孕期咖啡因暴露对子代肠系膜平滑肌细胞L型钙通道功能的影响

第二节 孕期咖啡因暴露对子代肠系膜动脉平滑肌细胞ryanodine敏感的胞内Ca2+释放的影响

第四部分 孕期咖啡因暴露对子代肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道电流的影响

第一节 孕期咖啡因暴露对子代肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa全细胞电流及瞬时外向电流的影响

第二节 孕期咖啡因暴露对子代肠系膜动脉BKCa单通道电流的影响极其分子机制

讨论

参考文献

缩略语中英文对照表

综 述: 大电导钙激活钾通道与心血管疾病

博士期间撰写的文章，参与的课题及所获奖励

致谢