血管性血友病因子与脑梗塞形成的相关性分析研究

摘要

脑血管疾病(cerebrovascular disease, CVD)是世界范围内成人致残的首要因素和第三位人口死亡的病因，也是老年人认知功能障碍和情感障碍的重要原因之一。由中国疾病预防控制中心2012年发布的国家卫生统计数据指出，我国为CVD的高发国家，CVD的发病率由2003年的6.6‰上升到2008年的9.7‰，2011年CVD的城镇人口死亡率为138.68/10万，是我国人口死亡的第二位原因。脑卒中（stroke）是指急性起病、迅速出现局限性或弥漫性脑功能缺失征象的脑血管性临床事件。脑梗塞（cerebra l infarction, CI）又称缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke, CIS）是由于脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化，约占全部脑卒中的80％。
　　血管内皮损伤，导致血小板和炎性细胞在内皮损伤部粘附、聚集，最终形成血栓是脑梗塞发生的主要原因。血管性血友病因子（von Willebrand factor, VWF）是一种大分子量的具有粘附功能的多聚体糖蛋白，其在止血与血栓过程中发挥着重要的作用。当血管壁受损时，VWF作为血小板膜糖蛋白（glycoprotein, GP）Ib与受损内皮细胞上的胶原之间的桥梁，可以介导血小板粘附到血管壁上。近年来，越来越多的研究证明高水平的VWF和低水平的血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS13）与缺血性脑卒中的发生发展有关，而且VWF介导的新型血小板粘附和激活的拮抗剂，作为一种更强大、安全的抵抗血栓形成紊乱的药物，也受到越来越多的关注。
　　我室曾研制了一套操作简单、特异性强、敏感性高的ELIS A试剂盒用于检测血浆中的VWF抗原含量(VWF:Ag)、VWF瑞斯托霉素辅因子活性(VWF:Rcof)及 VWF胶原结合能力(VWF:C B)。本研究使用这些ELISA试剂盒检测脑梗塞患者血浆中的上述指标，并结合ADAMTS13活性(ADAMTS13)检测、VWF多聚体电泳分析，为中国人群中的脑梗塞患者的分子病理机制研究提供更可靠的依据。
　　目的：
　　本研究旨在通过制备重组血小板糖膜蛋白Ibα-Fc融合蛋白(包含 IgG Fc段，rfGPIbα-Fc)，并检测脑梗塞患者和正常对照组血浆中的VWF:Ag、VWF:Rcof、VWF:CB和 ADAMTS13，分析这些指标之间的比值 VWF:Rcof/VWF:Ag, VWF:CB/VWF:Ag, ADAMTS13/VWF:Ag, ADAMTS13/VWF:Rcof, ADAMTS13/VWF:CB,并结合VWF多聚体电泳分析，进一步了解VWF及ADAMTS13在脑梗塞的发生发展中的作用。
　　方法：
　　（1）用CHO细胞培养表达rfGPIbα-Fc蛋白，用亲和层析柱纯化rfGPIbα-Fc，并用ELISA、10% SDS-PAGE电泳、Werstern blot方法检测其纯度和免疫学活性。
　　（2）收集苏州大学附属第一医院神经内科住院的94例脑梗塞患者血浆作为病例组和103例正常志愿者的血浆作为对照组。
　　（3）采用 ELISA方法检测 VWF:Ag、VWF:Rcof、VWF:CB水平，用荧光标记VWF73底物荧光共振能量转移试验（FRETS-VWF73）检测ADAMTS13活性。
　　（4）应用SPSS20.0和MedCalc13.2.2.0.统计软件分析上述指标及它们之间的比值与脑梗塞的关系。
　　（5）利用VWF多聚体电泳分析病例组及对照组血浆中的VWF多聚体形态。结果：
　　（1）成功制备富含rfGPIbα-Fc的细胞上清并获得高活性的rfGPIbα-Fc纯化产物。
　　（2）脑梗塞病例组的血浆VWF:Ag（M[IQR]，176%[114%-293%]）、VWF:Rcof（197%[105%-381%]）水平高于对照组（105%[61%-145%]；100%[60%-175%]，P<0.001）；病例组ADAMTS13(109%[80%-132%])、VWF:CB/VWF:Ag(0.43[0.28-0.90])、ADAMTS13/VWF:Ag(0.54[0.32-0.99])和 ADAMTS13/VWF:Rcof(0.57[0.29-0.91])水平明显低于对照组(117%[103%-146%]；1.13[0.72-1.81]；1.23[0.79-2.16]；1.18[0.71-1.79]，P<0.01)。高水平的VWF:Ag(OR=5.11,95%CI,1.49-17.50), VWF:Rcof(OR=5.04,95% CI,1.62-15.66)和低水平的VWF:CB/VWF:Ag(OR=5.91,95% CI,1.95-17.93), ADAMTS13/VWF:Ag(OR=9.11,95% CI,2.49-33.33), ADAMTS13/VWF:Rcof(OR=3.73,95%CI,1.39-10.03)与脑梗塞的发生有关。
　　（3） VWF多聚体电泳分析病例组与对照组的VWF多聚体形态无明显差别。
　　结论：
　　（1）获得了具有较高纯度和活性的rfGPIbα-Fc蛋白。
　　（2）血浆中高水平的VWF:Ag、VWF:Rcof及低水平的VWF:CB/VWF:Ag、ADAMTS13/VWF:Ag、ADAMTS13/VWF:Rcof与脑梗塞的发生有关；
　　（3）脑梗塞病人血浆中仅为VWF量的异常，而无VWF多聚体形态的异常。
　　（4）联合应用 VWF:Ag、 VWF:Rcof、 VWF:CB/VWF:Ag、ADAMTS13/VWF:Ag、ADAMTS13/VWF:Rcof可以更清楚的了解VWF与脑梗塞的关系，并为以后临床应用VWF靶向药物提供参考指标。

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引言

脑梗塞的形成

VWF分子结构和功能

VWF的合成与分泌

VWF参与脑梗塞的研究进展

第一部分 重组血小板膜糖蛋白Ibα的表达和纯化

材料和方法

结果

讨论

第二部分 VWF相关指标在脑梗塞中的检测及统计分析

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述: 血管性血友病因子与脑血管疾病关系的研究进展

攻读学位期间发表的论文及基金资助情况

中英文对照缩略词表

致谢