实时荧光定量PCR检测内、外源IGF-Ⅰ表达的实验研究

摘要

研究目的：
　　兴奋剂问题一直以来都是困扰所有体育赛事的主要问题之一，世界反兴奋剂机构禁止在一切运动赛事中使用兴奋剂。然而对于兴奋剂的有效检测却远远落后于兴奋剂的研发与使用。本实验通过研究基因兴奋剂 IGF-Ⅰ，建立一种检测区分内、外源基因表达的方法，为基因兴奋剂的有效检测提供理论依据。
　　研究方法：
　　本实验采用rAAV2介导IGF-Ⅰ的方法将外源基因注射进入小鼠肌肉，用以检测区分内、外源基因的表达情况。研究对象为30只雄性ICR小鼠，随机分为空白对照组（n=6）、注射3d组（n=6）、注射7d组（n=6）、注射14d组（n=6）、注射30d组（n=6）。构建含有目的基因IGF-Ⅰ的质粒，并进行病毒包装。在小鼠右侧后肢膝关节上方斜行进针进行病毒注射，每组按照不同的实验天数分别提取肌肉和血液中的DNA。通过在IGF-Ⅰ基因序列外显子2，3之间设计特异性的荧光探针来识别外源性IGF-Ⅰ基因，合成ITC基因以及相应的ITC探针，作为实验内部阈值调控的模版。以肌肉和血液提取得到的样本DNA为模板进行实时荧光定量PCR，实验过程中样本DNA、ITC质粒、IGF-Ⅰ目的探针、ITC探针、引物等放在同一体系中反应。实验结束后通过比较IGF-Ⅰ目的探针与ITC探针Ct值的大小，来排除实验过程中外界因素的干扰。通过比较相应组别的Ct值，来确定IGF-Ⅰ的表达。实验结果采用Excel与SPSS17.0统计软件进行分析。
　　研究结果：
　　（1）在实时荧光定量PCR过程中，通过实验仪器能够捕捉到目的探针荧光信号的积累，说明实验过程中注射的外源性 IGF-Ⅰ在小鼠体内得到表达，本实验设计的方法，能够检测到外源基因的表达。（2）不同时间获取肌肉，提取 DNA进行PCR，实验结果显示随着实验天数的增多Ct值逐渐增大，且3d组与7d组之间Ct值升高明显，14d组与30d组之间Ct值升高趋于缓慢；不同时间获取血液，提取DNA进行PCR，实验结果显示随着实验天数的增多Ct值变化的趋势不明显，但二者Ct值均小于空白对照组Ct值。（3）分别以肌肉和血液提取DNA为模版进行PCR，在3d，7d组，肌肉DNA的Ct值小于血液DNA的Ct值，两者之间差异显著（P<0.01）。14d，30d组，肌肉DNA的Ct值大于血液DNA的Ct值，且两者之间差异显著（P<0.01）。（4）以不同取材量肌肉、血液提取 DNA为模版进行PCR，实验结果显示，不同取材量PCR后的Ct值两者之间没有显著性的差异（P>0.05）。
　　研究结论：
　　（1）本实验建立的方法能有效的检测区分内、外源IGF-Ⅰ的表达。（2）不同取材时间对肌肉的检测结果有显著影响，对血液的检测结果没有影响。（3）不同取材组织对检测结果有较大影响。本实验结束显示，基因注射后7天内肌肉检测比血液检测更稳妥，注射7天后血液检测比肌肉检测更有利。（4）不同取材量对实验检测的结果没有影响。

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序言

1 文献综述

1.1兴奋剂及兴奋剂的检测

1.2胰岛素样生长因子（IGF）概述

1.3实时荧光定量PCR技术

1.4总结

2 材料与方法

2.1实验动物及分组

2.2携带人IGF-Ⅰ基因pTR-IGF-Ⅰ-GFP质粒的构建

2.3 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒的包装、纯化及滴度测定

2.4 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒肌肉注射

2.5实验动物的取材及测试指标

2.6 ITC模版的建立：引物-探针的设计

2.7 Real time PCR（探针法）体系及条件

2.8实验所需主要仪器及试剂

2.9数据统计处理

3 实验结果

3.1 pTR-IGF-Ⅰ-GFP质粒构建鉴定结果

3.2 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒包装及鉴定结果

3.3 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒滴度测定结果

3.4 Real time PCR仪检测精度测定结果

3.5实验结果特异性、可信性及重复性检测结果

3.6不同取材时间、不同取材组织Real time PCR实验结果

3.7不同取材量Real time PCR实验结果

4 分析与讨论

4.1腺相关病毒（AAV）作为基因导入体内载体的可行性

4.2实验结果的特异性、可信性及重复性

4.3不同取材时间、不同取材组织对实验检测结果的影响

4.4不同取材量对试验检测结果的影响

4.5本实验的创新点及实验不足之处

5 结 论

参考文献

7 攻读硕士学位期间公开发表论文

8 附 录

致谢