GPR50通过调控Notch和Wnt/β-catenin信号通路促进神经前体细胞的自我更新与神经元分化

摘要

目的：在中枢神经系统，神经前体细胞是一种多潜能细胞，他能够自我更新，同时也能分化形成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞。神经前体细胞增殖、分化、迁移并最终形成神经网络。上述任何一个过程的异常都会引起大脑的机能紊乱，并导致一些神经系统的疾病，如精神分裂症、自闭症和阿尔茨海默症。最近的研究表明，在严重的抑郁症和双极情感障碍的患者中，神经前体细胞的增殖和分化出现异常，这表明，神经前体细胞在抑郁症和双极情感障碍患者的致病机理中发挥一定的作用。
　　G蛋白偶联受体50(GPR50)，亦叫褪黑激素相关受体或ML1X，是位于X染色体上的G蛋白偶联受体。有研究表明，GPR50是重度抑郁症和双极情感障碍的一个风险基因。有研究也表明，抑郁症和双极情感障碍可能与大脑皮层的发育异常相关，在成年哺乳动物的脑垂体、下丘脑、海马中，GPR50有表达。此外，GPR50在胚胎13天的小鼠大脑中开始表达，在胚胎18天时表达量达到最高峰。这一系列的证据表明，GPR50在大脑的发育中可能起着很重要的作用。但是，关于GPR50在大脑中的功能和机制仍不清楚，所以我们主要探索GPR50对神经前体细胞的自我更新及分化的影响和分子机制。
　　方法：我们利用免疫荧光染色的方法，检测GPR50在分离的神经前体细胞和胚胎14天的小鼠大脑VZ区神经前体细胞上的表达。分离胚胎发育14天的小鼠侧脑室室管膜下区的神经前体细胞，用含B27、EGF、bFGF的DMEM/F12的培养液培养3-4天，用细胞核电穿孔技术转染GPR50的siRNA，每个电转杯转染siRNA200nM，然后将细胞按每孔500个细胞的密度种于96孔细胞培养板中培养8天，检测形成的神经球数目，按2x104的密度在24孔培养板中培养8天检测形成神经球的大小。用含B27和0.5％的胎牛血清的DMEM/F12分化培养液培养5天，然后分析神经前体细胞分化为星型胶质细胞的情况。在分子机制方面，通过实时定量PCR（q-PCR）和荧光素酶报告基因的方法，在转录水平上检测与神经前体细胞增殖和分化相关的一些基因的表达。
　　结果：
　　1）GPR50在VZ区和离体培养的神经前体细胞上表达。
　　2）用siRNA干扰GPR50后，神经前体细胞的自我更新能力减弱。
　　3）用siRNA干扰GPR50后，对星型胶质细胞的分化没有影响。
　　4）用siRNA干扰GPR50后，Hes1的表达水平升高，而TCF7L2，Ngn1，Ngn2和cyclin D1的表达水平降低。
　　结论：GPR50在VZ区和离体培养的神经前体细胞上表达。GPR50能促进神经前体细胞的自我更新，但是对星型胶质细胞的分化没有影响。GPR50可能是通过Notch信号通路和wnt/β-catenin信号通路来共同上调cyclin D1的表达，从而促进神经前体细胞自我更新；并且，通过上调Ngn1和Ngn2的表达来促进神经前体细胞向神经元的分化。

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英文摘要

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研究背景

参考文献

材料与方法

一 相关实验仪器

二 相关实验试剂

三 实验相关质粒

四 实验相关细胞系

五 相关溶液配置

六 实验动物

实验步骤

一、细胞系复苏

二、细胞系传代

三、细胞系转染

四、神经前体细胞转染

五、转化

六、摇菌

七、质粒小提

八、神经前体细胞分离及培养

九、细胞粘附玻片处理

十、细胞免疫荧光染色

十一、mRNA逆转录

十二、实时定量PCR（Quantitative real-time PCR）检测mRNA表达

十三、荧光素酶报告基因检测转录活性

十四、神经前体细胞的转染

十五、神经球大小和数目的检测

结果

第一部分 GPR50在神经前体细胞中表达

第二部分 GPR50促进神经前体细胞的自我更新

第三部分 GPR50不影响星型胶质细胞的分化

第四部分 GPR50抑制Notch信号通路，促进Wnt/β-catenin信号通路

参考文献

讨论

参考文献

结论

展望（不足与待改进之处）

综述: GPCRs在成年哺乳动物神经发生中的作用

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢