Toll样受体信号通路对异种心脏移植中的心肌细胞凋亡影响的初步研究

摘要

目的：在心脏移植后，急性血管性排斥反应导致心肌细胞间质出血、水肿，周围中性粒细胞浸润，血管内皮细胞死亡，最终细胞凋亡。本实验拟研究Toll样受体通路及其下游通路核因子-κB（NF-κB）在心肌细胞凋亡中的作用。
　　方法：在体外培养C57BL6小鼠的心肌细胞及SD大鼠和BALB/C小鼠的脾细胞。在体外建立C57BL6小鼠到BALB/C小鼠和SD大鼠的心脏移植细胞模型。将实验分为六组，A组：C57BL6小鼠心肌细胞+PBS液(PBS组)；B组：C57BL6小鼠心肌细胞+TNF-α(TNF-α组)；C组：C57BL6小鼠心肌细胞+BALB/C小鼠脾细胞(Mouse SC组)；D组：C57BL6小鼠心肌细胞+BALB/C小鼠脾细胞+BALB/C小鼠血清(Mouse SC+S组)；E组：C57BL6小鼠心肌细胞+SD大鼠脾细胞(Rat SC组)；F组：C57BL6小鼠心肌细胞+SD大鼠脾细胞+SD大鼠血清(Rat SC+S组)，共培养时间为108h。运用Annexin-V/PI法检测各组C57BL6小鼠心肌细胞凋亡，比较同种和异种免疫原对心肌细胞刺激效应的差别。RT-PCR法检测A组、C组、D组、E组、F组心肌细胞TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-7、TLR-9的表达，筛选出被激活的Toll样受体。利用相应的Toll样受体的阻断抗体抑制激活的Toll样受体，Annexin-V/PI法检测心肌细胞凋亡，Western-blot法检测其下游通道NF-κB的表达变化。
　　结果：运用酶消化法培养C57BL6小鼠的心肌细胞，细胞活性好，纯度达80-90％。供心心肌细胞凋亡检测实验中，TNF-α组、Rat SC组、Rat SC+S组的心肌细胞凋亡比例达71.31±7.71%、70.05±5.73%、68.61±4.71%，与PBS组、Mouse SC组、Mouse SC+S组相比，心肌细胞凋亡程度有明显差异（P<0.001）。检测未经处理的C57BL6小鼠心肌细胞的各Toll样受体信号的表达，均在相对较低水平，呈静息状态。各实验组中，在Rat SC组和 Rat SC+S组心肌细胞的TLR-2和 TLR-3的表达明显增高（P<0.05），其中 TLR-3的增高更加明显（P<0.05）。运用 TLR-3抗体来抑制心肌细胞TLR-3信号通路后，供心心肌细胞的凋亡比例减少（P<0.05），NF-κB p65蛋白的表达量降低（P<0.05）。
　　结论：1.在小鼠-大鼠心脏移植细胞模型中，TLR-2和TLR-3是异种免疫原诱导的心肌细胞凋亡过程中所激活的主要Toll受体种类，而TLR-3是受激活最明显的受体。
　　2.通过抑制TLR-3受体信号通路的激活，可抑制下游的NF-κB表达，减轻心肌细胞凋亡。

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前言

材料和方法

一、实验材料

二、C57BL6小鼠心肌细胞培养

三、心肌细胞的鉴定

四、脾细胞及血清的获取

五、C57BL6小鼠心肌细胞的异种及同种免疫原刺激实验

六、Annexin-V/PI试剂盒检测C57BL6心肌细胞凋亡

七、Quantitative RT-PCR法检测C57BL6小鼠心肌细胞Toll样受体表达

八、运用阻断抗体抑制TLR-3信号通路

九、蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测C57BL6小鼠心肌细胞的NF-κB p65蛋白的表达

十、统计学分析

结果

一、C57BL6小鼠心肌细胞的培养及光镜下观察结果

二、正常心肌细胞免疫荧光染色后光镜观察结果

三、Annexin V/PI法检测C57BL6小鼠心肌细胞的凋亡

四、RT-PCR法检测C57BL6小鼠心肌细胞Toll样受体表达

五、抑制TLR-3受体通路后，Annexin V法检测C57BL6小鼠心肌细胞的凋亡

六、Western-blot法检测C57BL6小鼠心肌细胞NF-κB p65蛋白的表达量

讨论

结论

参考文献

综述:异种移植与排斥反应的对策

英汉双解缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢