壳聚糖修饰多西他赛固体脂质纳米粒的构建及口服吸收机制的研究

摘要

目的：
　　制备壳聚糖（CS）及羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（HACC）修饰的多西他赛（DTX）固体脂质纳米粒（SLNs），并研究其口服生物利用度的改善机制。
　　方法：
　　采用乳化溶剂挥发法，制备DTX固体脂质纳米粒（DTX-SLNs），随后通过静电吸附的方式对纳米粒表面进行CS及HACC修饰。对制得的三种固体脂质纳米粒(DTX-SLNs,CS-DTX-SLNs,HACC-DTX-SLNs)进行理化性质表征，考察纳米粒在模拟胃肠液中的稳定性，考察纳米粒在pH1.2及pH6.8介质中的释放行为，采用X射线衍射（XRD）、差式扫描量热（DSC）及傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等方法观察药物在纳米粒中的变化。MTT法检测三种纳米粒对Caco-2细胞存活率的影响。建立Caco-2及FAE两种单层细胞模型，通过倒置显微镜观察细胞形态、测定跨膜电阻值、监测模型两侧碱性磷酸酶的分化及免疫荧光等方法确证模型的建立。采用高效液相色谱（HPLC）、流式细胞仪、共聚焦及荧光显微镜考察不同纳米粒在两种细胞模型上的摄取及转运。考察三种纳米粒对跨膜电阻及细胞紧密连接相关蛋白的作用。对HACC修饰纳米粒进行吸收机制的考察。随后进行三种纳米粒在大鼠体内的药动学评价；利用小动物成像仪观察包裹香豆素6的纳米粒（HACC-C6-SLNs）在大鼠体内的组织分布，并对胃肠道组织进行HE染色考察其组织安全性。
　　结果：
　　通过对DTX-SLNs的表面修饰及其理化表征，成功制得CS-DTX-SLNs及HACC-DTX-SLNs。与CS-DTX-SLNs相比，HACC-DTX-SLNs在模拟胃肠液中能稳定存在，且制得的三种纳米粒对药物的释放具有一定的控释效果。Caco-2及FAE单层细胞模型相关指标测定结果表明，2种细胞模型均已成功建立。三种空白载体对Caco-2细胞生长均无显著影响。Caco-2细胞摄取HACC-DTX-SLNs的能力显著大于DTX-SLNs和CS-DTX-SLNs，表明纳米粒经季铵盐壳聚糖修饰后能促进摄取。FAE单层膜型转运纳米粒的能力强于Caco-2单层模型。摄取机制研究表明，Caco-2细胞主要通过小窝蛋白途径摄取HACC-C6-SLNs，网格蛋白及大胞饮途径具有辅助作用。三种纳米粒均对紧密连接相关蛋白具有一定的下调作用，HACC-SLNs对紧密连接的影响最显著且这种下调作用具有可逆性。CS-DTX-SLNs和HACC-DTX-SLNs显著降低 Caco-2单层细胞膜的TEER值，随着纳米粒的移除，TEER值逐渐恢复。药动学研究结果表明，与DTX对照组相比，HACC-DTX-SLNs组AUC值增加2.45倍。胃肠道摄取结果显示，HACC-C6-SLNs主要通过回肠段吸收进入体内，且在Peyer’s结的吸收强于普通小肠段。组织安全性结果表明，纳米粒对胃肠道黏膜没有刺激性。
　　结论：
　　成功制备壳聚糖修饰多西他赛固体脂质纳米粒，其中HACC-DTX-SLNs稳定性好，并显著提高药物口服生物利用度，其促吸收机制依赖于跨膜内吞途径、细胞旁路途经及M细胞吞噬的共同作用。本研究为多西他赛的新型固体脂质纳米粒的设计和阐明其口服吸收机制提供理论依据。

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第一章 文献综述

1 固体脂质纳米粒

2 纳米粒在肠道的吸收机制

3 本文立题依据及研究内容

第二章 多西他赛固体脂质纳米粒的制备

1 材料及仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 本章小结

第三章 Caco-2与FAE单层细胞模型的建立及评价

1 材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 本章小结

第四章 固体脂质纳米粒的细胞学评价

1 材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 本章小结

第五章 多西他赛固体脂质纳米粒的体内研究

1 实验材料及仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 本章小结

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间科研成果

致谢