基于抗生素基因为报告基因的核酸酶效力检测

摘要

目的：
　　探究基因编辑工具剪切效率和脱靶效应评估新方法，开发新的基因编辑工具剪切效率和脱靶效应评估新体系。
　　方法：
　　选取质粒中博来霉素抗性基因作为实验候选报告基因。在原核系统构建Amp-Zeocin双抗质粒。同时在Zeocin抗性基因起始密码子ATG与第二密码子GCC间加入BaeI酶切位点，可实现金门克隆插入核酸片段方法。在真核体系构建G418/Kana-Zeocin双抗质粒，同时也在Zeocin抗性基因起始密码子ATG与第二密码子GCC间加入BaeI酶切位点，可实现金门克隆插入核酸片段方法。在候选报告基因中加入不同长度（包括3的整数倍和非3的整数倍）、不同种类（含有终止密码子和不含有终止密码子，指定序列和任意序列）的核酸片段，观察其抗性的保留与否；将人工构建的失活抗性基因使用基因编辑工具造成双链断裂，加入同源oligo，促使其在E.coil中发生同源重组重新恢复活性，验证其抗性功能的转换能力。
　　结果：
　　成功构建双抗质粒，在原核和真核系统中均可实现理想的“移码/终止—抗性消失，不移码—抗性保留”的二元模式，且移码或提前终止造成的抗性消失可通过基因编辑工具的剪辑作用得到重组恢复。
　　结论：
　　博来霉素抗性基因可用于基因编辑工具剪切效率和脱靶效应评估报告基因。

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英文摘要

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前言

一、设备与材料

1.主要仪器

2.主要试剂

3.相关生物信息学软件及网站

4.主要试剂配置

二、研究方法及过程

1.抗性载体的制备

2.博来霉素抗性基因突变耐受实验

3.基因编辑同源重组测试

三、讨论

四、结论

参考文献

综 述：人工重组核酸酶脱靶效应的检测

一、基因编辑为基因治疗提供了实际可行性

二、Off-target概念，重要性，目前各手段off-target发生情况

三、现有活性检测技术，及其用于脱靶效应检测的可能性和优缺点

四、脱靶效应检测的理想技术的基本要求

五、参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文、科研成果

中英文缩略词表

附录：20种氨基酸缩写表

致谢