NB-3介导神经轴突接触性抑制的信号传导机制的体外培养研究

摘要

目的：①应用E18.5的运动神经元与星形胶质细胞的体外共培养系统，观察运动神经元与星形胶质细胞之间NB-3的同源性相互作用所导致的轴突接触性抑制；②应用E18.5的运动神经元与星形胶质细胞的体外共培养系统，观察运动神经元与星形胶质细胞之间 NB-3的同源性相互作用所导致的mTOR信号通路的分子变化；③应用E18.5的运动神经元与星形胶质细胞的体外共培养系统，观察神经粘附分子家族中CHL1分子和 PTP家族中PTPσ分子的表达变化，以确定它们是否参与运动神经元与星形胶质细胞之间NB-3的同源性相互作用所导致的神经轴突的接触性抑制作用。
　　方法：首先选择C57BL/6J背景野生型P1-P3的小鼠，取其皮层组织分离消化所得的细胞培养，每3天剧烈摇晃培养皿以去除小胶质细胞并换液一次，7-10天以后传代，当星形胶质细胞达到80％以上时，用电转的方法分别给星形胶质细胞转染NB-3-Myc质粒或对照空载质粒，转染后的细胞分别种到24孔板中培养12 h。将来自E18.5的NB-3+/+或者NB-3-/-小鼠的第五层运动神经元分离消化，种到转染后的星形胶质细胞的24孔板中，共培养24 h。共培养之后的细胞经过PFA固定，用免疫染色的方法观察 mTOR信号通路分子的表达变化，以及神经粘附分子家族中 CHL1分子和PTP家族中PTPσ分子的表达变化。
　　结果：在E18.5运动神经元与星形胶质细胞的体外共培养系统中，运动神经元与星形胶质细胞上 NB-3的同源性相互作用引起了如下变化：①NB-3+/+运动神经元与不表达NB-3的星形胶质细胞接触之后，轴突继续生长，但是与表达NB-3的星形胶质细胞接触，轴突停止生长；NB-3-/-运动神经元与表达或不表达NB-3的星形胶质细胞接触，轴突仍然继续生长；②接触表达NB-3星形胶质细胞的NB-3+/+运动神经元与接触不表达NB-3星形胶质细胞的NB-3+/+运动神经元相比，mTOR信号通路中的Akt分子的总表达没有明显的变化，但是p-Akt，p-mTOR和p-S6分子的表达有明显的变化，这几个分子的表达变化表现为当 NB-3+/+运动神经元与星形胶质细胞上的NB-3同源性相互作用之后导致它们的表达有明显的下调；但是接触表达或不表达NB-3星形胶质细胞的NB-3-/-运动神经元与接触不表达NB-3星形胶质细胞的NB-3+/+运动神经元相比，上述分子的表达并没有明显的变化；③接触表达NB-3星形胶质细胞的NB-3+/+运动神经元与接触不表达 NB-3星形胶质细胞的NB-3+/+运动神经元相比，神经粘附分子家族中的CHL1和PTP家族的PTPσ分子，在NB-3+/+运动神经元上的表达都发生了明显的上调，CHL1在表达NB-3的星形胶质细胞上的表达也发生了明显的上调；但是接触表达或不表达 NB-3星形胶质细胞的NB-3-/-运动神经元与接触不表达NB-3星形胶质细胞的NB-3+/+运动神经元相比，CHL1和PTPσ分子的表达并没有明显的变化。④PTPσ被阻断之后，mTOR信号通路的活性上升。
　　结论：E18.5的运动神经元与星形胶质细胞的体外共培养系统证明：①运动神经元上与星形胶质细胞之间NB-3的同源性相互作用导致神经元的轴突接触性抑制；②运动神经元与星形胶质细胞之间NB-3的同源性相互作用导致mTOR下游信号通路的活性在运动神经元上下降；③神经粘附分子家族的CHL1分子和PTP家族的PTPσ分子参与调控运动神经元与星形胶质细胞之间的NB-3同源性相互作用所引起的轴突接触性抑制作用，并且CHL1和PTPσ与NB-3共同作用传导这种抑制性信号到运动神经元；④CHL1通过进一步促进NB-3的表达参与调控NB-3的同源性相互作用所导致的神经轴突的接触性抑制作用，PTPσ通过调控mTOR信号通路的活性参与调控这一信号传导机制。

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序言

1．材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2. 实验结果

2.1 NB-3在E18.5的运动神经元和星形胶质细胞中的表达

2.2 运动神经元与星形胶质细胞中NB-3的同源性相互作用导致运动神经元的接触性抑制

2.3 运动神经元与星形胶质细胞中 NB-3 的同源性相互作用使运动神经元中mTO R信号通路的活性下降

2.4 CHL1与PTPσ参与介导运动神经元与星形胶质细胞中NB-3的同源性相互作用

2.5 NB-3在星形胶质细胞与运动神经元中同源性相互作用的示意图

讨论

结论

参考文献

综 述：脊髓损伤后轴突再生的分子机制的研究进展

英文缩写略表

致谢